联合特殊染色在血管壁病变观测中的应用价值

李彦玮，王 伟，梅少帅，滕 飞，陈 东

首都医科大学附属北京安贞医院病理科，北京 100029

心血管疾病是我国城乡居民死亡的首位病因，高于肿瘤及其他疾病[1]。随着人口老龄化及城镇化进程的加速，今后10年心血管病患病人数仍将快速增长[2]，已成为当前重大的公共卫生问题。然而，有关心血管疾病病理改变方面的研究，尤其是针对组织成分改变量化的大宗病例研究，目前比较少见，这跟各大医院心血管病例标本量偏少有一定关系。HE作为观察镜下改变最基本的一种染色方法，难以有针对性地显示细胞成分的改变。Verhoeff-Van Gieson、AB/PAS和Masson 3种特殊染色技术主要着染细胞中弹力纤维、黏液、胶原纤维成分，能够直观而准确地展示出这些细胞成分的数量及形态改变。本研究联合病理实验室常用的Verhoeff-Van Gieson、AB/PAS和Masson特殊染色技术，观测了999例血管壁疾病标本中弹力纤维、胶原纤维及黏液等的变化情况，并对血管壁的微观改变做出了半定量分析，以期评估联合特殊染色技术在观察血管疾病病理改变中的应用价值，并为心血管疾病病理发生机制的研究提供组织形态学依据。

材料和方法

标本来源2014年1月至2017年9月在北京安贞医院病理科接收的心血管疾病标本。入组标准：(1)病历资料完整；(2)疾病诊断明确。排除标准：年龄小于18岁的病例。共有999 例入选，其中，男814 例，女185 例，中位年龄51.0 岁(18～83 岁)，平均发病年龄(49.7±9.6)岁；选取无心血管疾病的尸检血管壁作为对照。所有标本取材前均经10%中性缓冲福尔马林固定，常规石蜡包埋，连续石蜡切片4 μm。本研究经北京安贞医院医学伦理委员会批准，标本采集均获得患者本人或家属的知情同意，并签署知情同意书。

材料SAKURA VIP5 Tissue-Tek组织脱水机(美国SAKURA公司)，Leica ST5020多功能染色机(德国Leica公司)，HE染色试剂(哈尔滨格林标本技术开发有限公司)，Verhoeff-Van Gieson、AB/PAS、Masson染色试剂盒(珠海贝索生物技术有限公司)。

染色所有标本行常规HE染色[3]。

Verhoeff-Van Gieson染色：切片常规脱蜡至水；铁苏木素染色20 min；三氯化铁分化15 s，镜下观察弹力纤维染色清晰，蒸馏水冲洗；VG染液染色1 min，蒸馏水冲洗；95%乙醇急速分化，蒸馏水冲洗；梯度乙醇脱水，透明，封片。

AB-PAS染色：切片常规脱蜡至水；3%醋酸水溶液处理1 min；1%阿尔新蓝染液(pH值为2.5)染色10 min，蒸馏水冲洗；1%过碘酸氧化10 min，蒸馏水冲洗；schiff试剂染色15 min，蒸馏水冲洗；梯度乙醇脱水，透明，封片。

Masson染色：切片常规脱蜡至水；丽春红酸性品红染液染色5 min，蒸馏水冲洗；磷钼酸溶液处理5 min，镜下观察肌纤维着色，呈淡红色时直接倾掉磷钼酸；苯胺蓝染液复染3 min，倾掉染液；1%冰醋酸冲洗切片，至蓝色不再分化为止；梯度乙醇脱水，透明，封片。

特殊染色评分标准结合2016年美国心血管病理学学会及欧洲心血管病理学协会提出的共识[4]，全面评价血管壁内膜、中膜和外膜3层结构发生的病理改变。镜下分别观察HE染色及联合弹力/VG、AB/PAS、Masson特殊染色结果，根据以下5个方面评分：(1)内膜纤维性增厚；(2)平滑肌细胞核缺失；(3)弹力纤维断裂、减少；(4)黏液样细胞外基质聚集；(5)外膜炎细胞浸润进行评分；每项得1 分，共5 分。由两位病理医师对染色结果进行评分，并计算平均值。

统计学处理采用SPSS 20.0统计软件，染色评分结果以M(Q1，Q3)表示，组间比较采用Kruskal-Wallis检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

镜下观察HE染色镜下仅观察到少量弹力纤维断裂；联合Verhoeff-Van Gieson、AB/PAS和Masson特殊染色可观察到病变血管壁中膜的弹力纤维紊乱、断裂、减少，黏液样基质细胞外聚集，外膜胶原纤维增生。随着血管壁病变进展，可见更多弹力纤维的断裂和减少及胶原纤维增生(图1～2)。研究选取的无心血管疾病的尸检血管壁内、中、外膜均未见异常。

染色评分结果血管壁组999例患者中，主动脉窦瘤(aneurysm of sinus of valsalva，SVA)3 例，主动脉根部瘤(aortic root aneurysm，ARA)177 例，胸主动脉瘤(thoracic aortic aneurysm，TAA)78 例，腹主动脉瘤(abdominal aortic aneurysm，AAA)17 例，全胸腹主动脉瘤(total thoracoabdominal aortic aneurysm，tTAAA)32 例，主动脉夹层(aortic dissection，AD)692 例；其中，AD的联合特殊染色中位评分最高[3.7(3.5，3.8)分]，TAA最低[2.7(2.9，3.0)分]；SVA(Z=3.857，P=0.040)、ARA(Z=14.307，P=0.000)、TAA(Z=26.939，P=0.000)、AAA(Z=22.412，P=0.000)、tTAAA(Z=15.926，P=0.000)和AD组(Z=39.213，P=0.000)的联合特殊染色中位评分均明显高于HE染色(表1)。

讨 论

在常规病理工作中，HE是观察疾病镜下改变最基本的一种染色方法。然而，这种染色一般仅能显示细胞核和细胞浆的结构，难以对细胞成分做出特异性的显示。Verhoeff-Van Gieson、AB/PAS和Masson 3种特殊染色技术，主要着染细胞中弹力纤维、黏液、胶原纤维成分，能够直观而准确地显示出这些细胞成分的数量及形态改变。

心血管系统的大动脉分为3层：内膜由内皮、内皮下层构成；中膜的主要结构是弹力纤维和胶原纤维[5]，有40～70层弹性膜，弹力纤维是维持主动脉轴向回缩力的主要成分；外膜较薄。本研究选取了6种类型动脉瘤的病例，病理结果发现均有不同程度的内膜纤维性增厚，中膜弹力纤维减少、变平、断裂，平滑肌细胞核缺失，排列紊乱，黏液样细胞外基质聚集及外膜炎细胞浸润。按照内膜纤维性增厚、平滑肌细胞排列紊乱、弹力纤维断裂、减少、黏液样细胞外基质聚集及外膜炎细胞浸润评分，AD评分最高，TAA评分最低；6种类型动脉瘤病例联合特殊染色的染色评分均明显高于HE染色，提示联合特殊染色技术确实较HE染色能够更好地评价血管壁中3层结构的病理改变。

A.HE；B. Verhoeff-Van Gieson染色，弹力纤维显示黑色，胶原纤维显示红色；C. AB/PAS染色，酸性黏液显示蓝色，中性黏液显示红色；D. Masson染色，肌纤维显示红色，胶原纤维显示蓝色

A.HE；B. Verhoeff-Van Gieson：black for elastic fibers and red for collagens；C.AB/PAS：blue for acid mucus and red for neutral mucus；D. Masson：red for muscle fibers and blue for collagens

图1主动脉根部瘤

Fig1Aortic root aneurysm

A.HE；B. Verhoeff-Van Gieson染色，弹力纤维显示黑色，胶原纤维显示红色；C. AB/PAS染色，酸性黏液显示蓝色，中性黏液显示红色；D. Masson染色，肌纤维显示红色，胶原纤维显示蓝色

A.HE；B.Verhoeff-Van Gieson：black for elastic fibers and red for collagens；C.AB/PAS：blue for acid mucus and red for neutral mucus；D. Masson：red for muscle fibers and blue for collagens

图2主动脉夹层

Fig2Aortic dissection

表 1 HE染色与联合特殊染色评分的比较Table 1 Comparison of scores between HE stain and combined special staining

SVA：主动脉窦瘤；ARA：主动脉根部瘤；TAA：胸主动脉瘤；AAA：腹主动脉瘤；tTAAA：全胸腹主动脉瘤；AD：主动脉夹层

SVA：aneurysm of sinus of valsalva；ARA：aortic root aneurysm；TAA：thoracic aortic aneurysm；AAA：abdominal aortic aneurysm；tTAAA：total thoracoabdominal aortic aneurysm；AD：aortic dissection

本研究还选取了无心血管疾病的尸检血管壁组织作为对照，镜检结果显示血管壁内、中、外膜均未见异常。通过对比联合特殊染色及HE染色结果，发现病变的血管壁组织，其内膜发生不同程度的纤维化，中膜常有弹力纤维的断裂、消失以及平滑肌细胞核缺失等，外膜可有不同程度的炎细胞浸润。有报道认为，血管壁组织中弹力纤维断裂、排列紊乱，胶原纤维、平滑肌细胞含量改变与动脉管壁的重塑有关[6- 7]。动脉壁的中膜层，胶原纤维和平滑肌细胞排列的变化参与了主动脉夹层的形成[8]。由于弹力纤维的断裂与减少，可以导致血管中膜的顺应力下降，从而引起血管壁事件的发生。本研究结果与以往报道一致。

综上，本研究结果显示，使用Verhoeff-Van Gieson、AB/PAS和Masson联合特殊染色技术能更好地观察血管壁病变中弹力纤维、胶原纤维及黏液等成分的病理改变，可应用于血管壁病变的观测。

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