外周血循环肿瘤细胞在不同阶段和不同类型肺癌中的价值研究

肖鹏，梅家转，李瑞君，白桦，栗敏，刘桂举郑州人民医院肿瘤内科，郑州450003

肺癌是对人类生命威胁最大的恶性肿瘤之一，其发病率和病死率均居恶性肿瘤中前列，且近年来均呈逐年上升趋势，一直是全球关注的重点问题。发病隐匿、易复发转移是肺癌重要的死亡原因之一[1-2]。循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）是近年提出的一种新概念，是存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称。大部分CTC可被自身免疫系统识别并清除，但小部分CTC能够逃逸并随血液循环转移至其他部位，形成转移灶，这也是肿瘤转移的至关重要的组成部分，在肿瘤分期、监测及预后判断等方面具有重要的临床应用价值。不同类型、不同阶段的肿瘤，CTC的分布及侵袭能力也不尽相同[3-4]。根据世界卫生组织病理学分类原则，肺癌可以分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌两种类型，非小细胞肺癌又可以细分为腺癌、鳞状上皮细胞癌和大细胞癌3种类型[5]。根据国际抗癌联盟（Union for International Cancer Control，UICC）第七版肺癌TNM分期标准，肺癌T分期包括T0、Tis、T1（a/b/c）、T2（a/b）、T3和 T4；N 分期包括 N0、N1、N2和N3；M 分期包括 M0和 M1（a/b/c）[6]。本研究拟通过免疫磁珠阴性富集法联合免疫细胞荧光染色法检测不同阶段、不同类型肺癌患者外周血中CTC的情况，并分析其与患者临床特征的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2012年2月至2014年2月于郑州人民医院接受治疗的148例肺癌患者为肺癌组。纳入标准：①临床症状、实验室检查及病理诊断等均符合2011版原发性肺癌诊疗规范中关于肺癌的诊断标准[7]；②入组前均未接受任何抗肿瘤相关治疗；③均首次被诊断为肺癌。排除标准：①无病理诊断结果；②合并其他原发性肿瘤或转移性肿瘤者；③依从性差或有精神疾病者。选取同期于本院接受治疗的79例肺部良性疾病患者为肺部良性疾病组。纳入标准：①符合肺部良性疾病的诊断；②临床所有检查均排除肿瘤性疾病。另外，选取同期于本院接受体检的15例健康成人的检测结果作为对照。纳入标准：①全身体检基本正常；②无肺癌相关高危因素。肺癌组患者中，男93例，女55例；年龄21～72岁，平均（45.19±11.03）岁。肺部良性疾病组患者中，男50例，女29例；年龄18～70岁，平均（44.28±10.76）岁。健康对照组中，男10例，女5例；年龄20～71岁，平均（43.54±12.52）岁。3组对象的性别、年龄等一般资料比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 主要试剂及仪器

人抗CD45磁珠抗体试剂盒、鼠抗人CD53单克隆抗体、人藻红蛋白（phycoerythrin，PE）和异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）均购自加拿大Stemcell公司；鼠抗人Pan-CK、甲状腺转录因子-1（thyoid transciiption factor-1，TTF-1）和DAPI单克隆抗体均购自美国Cell Signaling公司；FACS AriaⅢ流式细胞仪购自美国BD公司。

1.3 方法

1.3.1 标本采集 入组前，采集所有入组对象的外周血7.5 ml，具体操作步骤：选择肘正中静脉，严格消毒，采用真空采血管（含EDTA）采集7.5 ml外周血，弃去前端1.5 ml血液，以避免血管内皮细胞和上皮细胞污染血液。在采集后24 h内完成外周血CTC的富集，以保证结果的准确性。

1.3.2 免疫磁珠阴性富集法捕获CTC 去除红细胞：向7.5 ml外周血中加入红细胞裂解液，振荡混匀，离心后弃上清，后用10%胎牛血清和含1 mmol/L EDTA的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）重悬细胞。去除白细胞：富集CTC，遵循试剂盒说明书要求，向重悬细胞液中添加人抗CD45磁珠抗体去除白细胞，随后再次进行细胞重悬。再次去除白细胞，同时富集CTC：向细胞重悬液中添加PE标记的鼠抗人CD53单克隆抗体进行免疫荧光染色，后使用PE阳性试剂盒进行筛选，完成CTC的富集。具体操作步骤严格参照试剂盒说明书进行。

1.3.3 流式细胞仪检测经免疫荧光染色后的CTC参照参考文献[8]进行以下操作：将富集后的CTC上机（流式细胞仪），并同时向其中添加FITC标记好的鼠抗人Pan-CK、TTF-1和DAPI单克隆抗体，FACS AriaⅢ流式细胞仪鉴定CTC并进行计数，随后采用FlowJo 7.2.5软件对流式细胞仪的检测结果进行分析。

1.4 随访方法

采用电话、上门随访或门诊复诊等方式对肺癌组患者进行随访，以了解CTC检出与未检出肺癌患者的生存情况，随访日期截至患者死亡或2017年2月。

1.5 判定标准

CTC是CD45抗体阴性，而Pan-CK、TTF-1和DAPI均阳性的细胞。由于健康对照组和肺部良性疾病组的外周血中也可能存在CTC，故设定此类CTC的阈值均为1，只有所有外周血CTC数值＞阈值时才纳入统计学分析。

1.6 统计学分析

采用SPSS 19.0软件对数据进行分析。计数资料以率（%）表示，组间比较采用χ2检验；计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CTC检出率的比较

健康对照组、肺部良性疾病组和肺癌组的CTC检出率分别为6.67%（1/15）、17.72%（14/79）、93.92%（139/148），3组CTC检出率比较，差异有统计学意义（χ2=154.2，P＜0.01）；其中，肺部良性疾病组与健康对照组的CTC检出率比较，差异无统计学意义（χ2=0.47，P＞0.05）；肺癌组的CTC检出率明显高于肺部良性疾病组和健康对照组，差异均有统计学意义（χ2=135.2、85.6，P＜0.01）。

2.2 CTC检出率与肺癌患者临床特征的关系

临床分期为Ⅲ～Ⅳ期、M分期为M1期的肺癌患者的CTC检出率分别高于临床分期为Ⅰ～Ⅱ期、M分期为M0期的患者，差异均有统计学意义（P＜0.05），而不同性别、年龄、组织学类型、T分期和N分期的肺癌患者的CTC检出率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表1）

2.3 CTC检出与未检出肺癌患者生存率的比较

截至随访结束，CTC检出肺癌患者的生存率为23.78%，低于CTC未检出肺癌患者的63.85%，差异有统计学意义（χ2=4.86，P=0.03）。

3 讨论

易发生远处转移是肺癌作为恶性肿瘤的重要原因之一，严重影响了肺癌患者的治疗效果和预后。有研究显示，不同类型、不同临床分期的肺癌，其远处转移情况也不同，这提示远处转移能力与肺癌的类型及临床分期有关[9]。相关研究表明，CTC是肿瘤发生转移的前提和关键环节，但CTC具有较大的异质性，肿瘤类型不同或肿瘤所处的阶段不同，其能力和状态也不尽相同，仅有小部分CTC可在循环的外周血中完成转移并定植形成转移灶，因此，实时监测外周血中CTC的情况对临床肿瘤的治疗及预后判断具有重要意义[10]。

表1 CTC检出率与肺癌患者临床特征的关系

近年来，随着科学技术的飞速发展，CTC的检测技术也在不断进步更新，目前CTC的检测技术主要包括免疫磁性捕获分离技术、免疫组织化学技术、以PCR为基础的检测技术、FISH技术、细胞形态学分析和基于微流控芯片的CTC捕获技术等，其中免疫组织化学技术仍是评价CTC检测方法的“金标准”[11]。本研究通过免疫磁珠阴性富集法联合免疫细胞荧光染色法（流式细胞仪检测）对CTC进行检测，结果显示肺癌组、肺部良性疾病组和健康对照组的CTC检出率分别为93.92%、17.72%和6.67%，差异有统计学意义（P＜0.01），表明该方法在CTC的检测上具有较高的敏感度和特异度，这与尹寒露等[12]研究结果基本一致。本研究还发现，临床分期为Ⅲ～Ⅳ期、M分期为M1期肺癌患者的CTC检出率分别高于临床分期为Ⅰ～Ⅱ期、M分期为M0期的患者（P＜0.05），这提示CTC检出率与肺癌患者的临床分期有关。这与李晶等[13]研究结果基本一致，但也有研究认为CTC检出率与肺癌的临床分期无关[14]，推测其原因可能与研究对象的纳入情况和样本量有关。

综上所述，大部分肺癌中均存在CTC，其检出率与肺癌的临床分期及远处转移相关，早期检测CTC有利于肺癌患者病情的评估。

[1]Travis WD,Travis LB,Devesa SS.Lung cancer[J].Cancer,1995,75(1 Suppl):191-202.

[2]石远凯,孙燕,于金明,等.中国晚期原发性肺癌诊治专家共识(2016年版)[J].中国肺癌杂志,2016,19(1):1-15.

[3]陈卓,许新华.循环肿瘤细胞分子特性研究进展[J].实用医学杂志,2015,31(5):852-854.

[4]Fabisiewicz A,Grzybowska E.CTC clusters in cancer progression and metastasis[J].Med Oncol,2017,34(1):12.

[5]黄受方.国际肺癌研究协会/美国胸科学会/欧洲呼吸学会国际多学科肺腺癌分类(2011年版)解读[J].中华病理学杂志,2011,40(12):793-796.

[6]叶波,杨龙海,刘向阳.最新国际肺癌TNM分期标准(第7版)修订稿解读[J].中国医刊,2008,43(1):21-23.

[7]支修益,吴一龙,马胜林,等.原发性肺癌诊疗规范(2011年版)[J].中国肺癌杂志,2012,15(12):677-688.

[8]黄同海,王正,李富荣.循环肿瘤细胞检测的研究新进展[J].中国肿瘤临床,2007,34(8):476-479.

[9]刘贤忠,张丽婷,童卫泉,等.肺癌侵袭和转移分子机制研究进展[J].中国医学科学院学报,2016,38(1):108-112.

[10]褚佩英.肿瘤转移相关标志物——循环肿瘤细胞(CTC)[J].临床检验杂志(电子版),2014,3(3):675-677.

[11]任传利,韩崇旭,王大新.实体瘤外周血循环肿瘤细胞与转移相关性的研究进展[J].中华肿瘤防治杂志,2011,18(1):74-77.

[12]尹寒露,阴建,陈立文,等.分类检测非小细胞肺癌患者外周血中循环肿瘤细胞的临床价值[J].中华肿瘤杂志,2016,38(9):677-681.

[13]李晶,姜北,万鹏,等.晚期非小细胞肺癌患者循环肿瘤细胞检测的临床意义[J].中国全科医学,2013,16(9C):3202-3204;3207.

[14]Osaki T,Oyama T,Gu CD,et al.Prognostic impact of micrometastatic tumor cells in the lymph nodes and bone marrow of patients with completely resected stage I nonsmall-cell lung cancer[J].J Clin Oncol,2002,20(13):2930-2936.