化学发光免疫分析法与酶联免疫斑点试验诊断结核病的相关性研究

柏明见 何美琳 冯璟 梁国威

根据世界卫生组织（World Health Organization，WHO）提供的数据显示，2016年全世界新发结核病患者约为1 040万例［1］。结核病的早期诊断对预防结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）的传播至关重要，目前有多种检测手段可用于结核病的诊断，如培养法、抗酸染色法、核酸检测技术、结核菌素试验（purified protein derivative，PPD）以及γ-干扰素释放试验（interferon-gamma releasing assays，IGRAs）等。

涂片抗酸染色法简便易行、应用广泛，但有两方面的明显缺点：① 诊断肺结核的敏感度低于50%；② 抗酸染色呈阳性时，常不能确定是否为MTB［2］。MTB培养法是诊断结核病的“金标准”，但耗费时间长（约2～5周），可能延误结核病患者的及时诊断和治疗［3］。核酸检测技术诊断结核病的时间短（＜2 h），对抗酸染色阳性的结核病患者有较高的阳性率，而对抗酸染色阴性的结核病患者的敏感度仅为0.70，仍有漏诊的可能［4］。

γ-干扰素（interferon-gamma，IFN-γ）是T淋巴细胞受MTB刺激时产生的保护性免疫效应分子。目前常用IGRAs中的酶联免疫斑点试验（enzymelinked immunospot assay，ELISPOT）测定 IFN-γ，其主要原理是通过ESAT-6和CFP-10两种特异性靶抗原刺激T淋巴细胞，从而产生IFN-γ，最终根据斑点数目读取结果。IGRAs主要用于诊断MTB的潜伏感染和判断人接种疫苗后机体的免疫状态［5］，但不建议用于对活动性结核病的诊断［6］。ELISPOT法的检测结果往往由仪器和人工两种方法读取，结果常出现偏差，因此，寻找一种能够由仪器直接检测IFN-γ并自动产生结果的方法，将会进一步减少误差，增加结果的准确性。本研究拟对化学发光免疫分析法（chemiluminescence immunoassay，CLIA）和ELISPOT法检测IFN-γ的相关性进行评价。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2018年8月7日—9月4日北京航天中心医院收治的28例疑诊结核病患者作为研究对象，其中男性13例，女性15例；年龄45～81岁，平均（63±18）岁；所有疑诊患者均有结核病的相应临床或影像学表现。

1.2 标本收集及检测方法 采集所有患者的肝素抗凝静脉血4管，同时收集其痰液2 mL或留取24 h尿液离心取沉淀。

1.2.1 采用ELISPOT法检测3管肝素抗凝全血的IFN-γ。判断标准如下：① 阳性标准：当阴性对照孔斑点数为0～5个时，抗原A（或抗原B）斑点数－阴性对照孔斑点数≥6个，则判断为阳性；当阴性对照孔斑点数≥6个时，抗原A（或抗原B）斑点数≥2×阴性对照孔斑点数，则判断为阳性。② 阴性标准：阳性对照孔结果良好且抗原A或抗原B达不到上述标准时，判断为阴性。

1.2.2 采用CLIA法检测1管肝素抗凝全血的IFN-γ，判断标准按照说明书进行。为方便进行结果对比，将阴性及不确定的结果均确定为阴性。

1.2.3 对患者的痰液或尿液标本进行MTB培养，操作步骤按说明书进行。若超过45 d未生长可疑菌落，则结果报告为未生长抗酸杆菌。

1.3 统计学方法 采用SPSS 16.0统计软件分析数据，对CLIA法与ELISPOT法的检测结果进行Kappa相关性分析。当Kappa值≥0.75时，认为两种试验的一致性较好；当0.40≤Kappa值＜0.75时，认为两种试验的一致性一般；当Kappa值＜0.40时，认为两种试验的一致性较差。绘制受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic，ROC），计算ROC 曲线下面积（area under curve，AUC）。双侧 P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTB培养结果 28例疑诊结核病的患者中，经MTB培养，最终确诊肺结核3例，泌尿系结核1例。

2.2 IGRAs两种检测方法的结果比较 28例疑诊结核病患者中，7例ELISPOT法和CLIA法结果均呈阳性，2例ELISPOT法结果呈阳性且CLIA法结果呈阴性，3例ELISPOT法结果呈阴性且CLIA法结果呈阳性，16例ELISPOT法和CLIA法结果均呈阴性，见表1。经Kappa相关性分析显示，二者相关性为0.602。

表1 28例疑诊结核病患者采用IGRAs两种方法的检测结果比较

2.3 IGRAs两种检测方法与MTB培养法的结果比较 CLIA法诊断结核病的AUC为0.875〔95%可信区间（95%CI）＝0.743～1.007〕，敏感度为100%，特异度为75%；ELISPOT法诊断结核病的AUC为0.750（95%CI＝0.481～1.019），敏感度为 75%，特异度为75%。见表2。ELISPOT法和CLIA法诊断结核病的ROC曲线分析见图1。

表2 28例疑诊结核病患者采用IGRAs两种方法检测结果与MTB培养结果比较

图1 CLIA法和ELISPOT法诊断结核病的ROC曲线

3 讨论

近年来，用ELISPOT法检测MTB特异性淋巴细胞的应用日趋成熟，该技术主要用于结核病的诊断［7］，通常是诊断潜伏性结核病，但无区分活动性还是非活动性结核的能力。ELISPOT法的结果读取主要有仪器读取和人工读取两种方式，有研究显示，二者的一致性较好（Kappa值为0.71），但仍有部分结果的读取并不吻合［8］，同时ELISPOT法要求高，操作复杂，难以实现高通量［9］，因此需要一种新的方法来读取特异性淋巴细胞释放的IFN-γ。本研究采用CLIA法检测IFN-γ，该方法的测试过程和结果判读均为自动化，极大地提高了结果读取的准确性。

本研究通过对CLIA法与ELISPOT法进行相关性分析，从而评价二者结果的一致性，为临床疑诊结核病患者提供新的诊断方法。通过文献检索发现，国内亦进行类似的相关性分析实验。如梁艳等［10］研究发现，ELISPOT法和CLIA法的一致率为66.29%，因此考虑CLIA法可用于结核病的辅助诊断。

本研究发现，CLIA法和ELISPOT法二者检测IFN-γ的相关性尚可。CLIA法诊断结核病的AUC稍高于ELISPOT法，其中敏感度为1.00，原因可能是CLIA法检测敏感，结果读取准确性高于ELISPOT法，考虑CLIA法检测IFN-γ具有高通量、结果读取准确等优点，易于在临床中开展。

综上所述，CLIA法与ELISPOT法检测MTB特异性淋巴细胞释放的IFN-γ相关性尚可，CLIA法诊断结核病的敏感性和特异性较好，尤其是敏感性较高，检测IFN-γ的结果易于读取，容易进行高通量检测，有一定的临床应用前景。

1 World Health Organization.Global tuberculosis report 2017［R］.Geneva：WHO，2017.

2 Jafari C，Olaru ID，Daduna F，et al.Rapid diagnosis of pulmonary tuberculosis by combined molecular and immunological methods［J］.Eur Respir J， 2018，51（5） ：1702189.

3 Pheiffer C，Carroll NM，Beyers N，et al.Time to detection of Mycobacterium tuberculosis in BACTEC systems as a viable alternative to colony counting［J］.Int J Tuberc Lung Dis， 2008，12（7）：792-798.

4 Steingart KR，Sohn H，Schiller I，et al.Xpert® MTB/RIF assay for pulmonary tuberculosis and rifampicin resistance in adults［J］.Cochrane Database Syst Rev， 2013，（1）：CD009593.

5 Menzies D，Pai M，Comstock G.Meta-analysis：new tests for the diagnosis of latent tuberculosis infection: areas of uncertainty and recommendations for research［J］.Ann Intern Med， 2007，146（5）：340-354.

6 World Health Organization.Use of tuberculosis interferon-gamma release assays（IGRAs）in low- and middle- income countries：policy statement［R］.Geneva：WHO，2011.

7 胥魏，邹耀红.由结核感染T细胞斑点试验诊断并经病理证实的干燥综合征合并肺结核 1例［J］.实用检验医师杂志，2011，3（1）：53-55.

8 Agarwal S，Nguyen DT，Lew JD，et al.Comparing TSPOT assay results between an Elispot reader and manual counts［J］.Tuberculosis (Edinb)， 2016，101S：S92-98.

9 中华医学会结核病学分会，《中华结核和呼吸杂志》编辑委员会.γ-干扰素释放试验在中国应用的建议［J］.中华结核和呼吸杂志，2014，37（10）：744-747.

10 梁艳，王兰，张翠英，等.两种γ干扰素释放试验及PPD试验结果在结核感染诊断中的比较［J］.中国防痨杂志，2015，37（7）：740-747.