心理应激大鼠部分福利相关指标测评

梁 磊, 董 敏, 尤金炜, 胡文娟, 陈 莉, 恽时锋

(解放军南京总医院比较医学科, 全军实验动物科普与伦理教育基地,全国科普教育基地, 南京 210002)

目前，实验动物福利的重要性已得到了普遍认同，并已成为动物实验研究中的重要内容。有文献[1-3]报道动物福利水平高低会对实验动物的状态产生影响，而动物实验中的抓取、穿刺、手术等操作和药物作用引起的不适、疼痛以及环境压力等都是福利损伤因素，可能导致实验动物福利水平的下降，进而使动物实验结果产生偏差。因此，许多科研工作者在这些方面进行了广泛而深入研究，并取得了一定成果。但采血、手术或束缚等直接刺激所导致的福利损伤只是动物福利的一个方面，心理健康也是实验动物福利的重要组成部分，身心健康的实验动物才是“康乐”动物，才是真正标准的实验动物[4]。心理刺激往往通过感官刺激、动物间的信息交流等形式产生，负面刺激会使实验动物产生心理应激，心理福利受损。心理应激的动物其福利水平发生了什么变化，整体福利状况如何，关于此方面报道较为罕见。本文以SD大鼠为对象，观测承受一定时间的负面感官刺激及群体交流后，大鼠各项福利相关指标的变化，探讨心理健康对实验动物整体福利水平的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物与饲育环境

8周龄SPF级雄性SD大鼠30只，体质量180～200 g，由中国人民解放军南京总医院比较医学科提供[SCXK(军)2012-0014]，屏障环境[SYXK(军)2012-0047]饲养。60Co灭菌全价颗粒饲料与高温高压灭菌饮用水，自由采食。

1.2 主要仪器与试剂

动物行为学视频跟踪系统(#Etho Vision XT，Noldus Information Technology，荷兰)，冰冻离心机(#Neofuge 15R，Heal Force，中国香港)，PCR仪(#Step One Plus，Applied Biosystems，美国)，PCR引物(Invitrogen Biotechnology, 美国), 荧光定量PCR检测系统(LightCyclery 96, Roche, 瑞士), 多轨电生理仪(#Omniplex，Plexon, 中国), Trizol Reagent(#15596-026, Thermo, 美国), 反转录试剂盒(#K1622,Thermo, 美国), ELISA试剂盒(Sigma-Aldrich, 美国),免疫组织化学试剂盒(Sigma-Aldrich, 美国), 组织切片扫描仪(#Pannoramic MIDI, 3D Histech, 匈牙利),组织切片分析软件(Pannoramic viewer、Quant center, 3D Histech, 匈牙利), 其他检测相关试剂、耗材及器材均由武汉谷歌生物科技有限公司提供。

1.3 实验分组

SD大鼠随机分为3笼, 编号1～3, 每笼10只大鼠, 编号1～10。其中电击组: 1号笼和2号笼的1～5号大鼠为电击组，共计10只; 实验组(T组): 1号笼和2号笼的6～10号大鼠为实验组，共计10只; 对照组(C组): 3号笼10只大鼠为对照组。

1.4 实验方法

参考文献[5]方法: 电击组大鼠每日9∶30～10∶00给予足部电击, 每5 min 1次, 共30 min。电击组大鼠仅作为应激源，不计入最终实验处理; 实验组大鼠与电击组大鼠同笼饲养，进行电击时不接受电击但近距离旁观电击过程，接受感官刺激; 对照组大鼠正常饲养，电击时隔离，不接受电击产生的任何刺激。实验干预共计14 d, 次日行旷场实验[6,7]后处死大鼠，采取样本用于指标检测。

1.5 指标检测

1.5.1 旷场实验 实验过程中观察并记录实验组大鼠日常表现。旷场为不透明材料制成的箱式容器,尺寸为50 cm×50 cm×30 cm, 箱底划分为等面积的25个正方形方格，四周有高30 cm的黑色周壁,无顶。实验时光照设置为黑夜模式，背景噪音控制在65 dB以下, 从同一位置将大鼠放入中央格, 采用动物行为学视频跟踪系统记录每只大鼠10 min内的行进总路程、平均速度、中央活动路程及中央活动时间。每检测1只大鼠后使用酒精清理实验箱,避免遗留粪便、气味等影响后续实验。

1.5.2 体质量与血压指标测定 记录实验期间各组大鼠体质量变化, 实验结束计算体质量增加: 实验期间每间隔5 d使用多轨电生理仪(尾部无创)监测1次血压，记录收缩压数据，每只大鼠每次测量3个数据，取平均值。

1.5.3 部分免疫学及内分泌指标测定 实验结束尾静脉采集各组大鼠血液样本，分离血清，酶联免疫吸附(ELISA)法检测血清白细胞介素-2(IL-2)、肾上腺素(EPI)、去甲肾上腺素(NE)、促肾上腺皮质激素(ACTH)和皮质酮(CORT)水平; 采集各组大鼠胸腺和脾脏样本，计算脏器系数。

1.5.4 实时荧光定量PCR检测肝细胞核因子-κB(NF-κB) p65 mRNA相对含量 取大鼠肝脏组织，充分裂解后按Trizol操作说明提取总RNA。而后按照反转录试剂盒说明操作, 反转录cDNA, 反转录体系为 20 μL，每管加入总 RNA 4 μg, 37 ℃反应 1 h，70 ℃ 15 min。反转录后的cDNA用于RT-PCR反应，引物为:

p65 上游引物5'- AAGCACAGATACCACCAAGACAC- 3'下游引物5'- CGCACTGCATTCAAGTCATAGTC - 3'扩增片段长度324 bp，退火温度60 ℃;

GAPDH上游引物5'-GTGACGTTGACATCCGTAAAGA- 3'下游引物5'- GTAACAGTCCGCCTAGAAGCAC - 3'扩增片段长度287 bp，退火温度60 ℃。

反应体系: SYBR Premix Ex Taq II(2×)10 μL，Cdna 2 μL, 上、下游引物各 1 μL(10 μmol/L)，加入 Nuclease-Free Water至 20 μL。反应条件: 95 ℃预变性 3 min，(95 ℃ 10 s，60 ℃ 60 s)× 40 个循环，每个样品3次重复。将对照组大鼠基因表达水平定为1，比较实验组的基因表达差异。

1.5.5 免疫组织化学检测大鼠肝细胞NF-κB p65蛋白表达 取大鼠肝脏组织, 石蜡包埋、切片, SP法检测, 严格按照免疫组织化学试剂盒说明操作, 染色后由组织切片扫描仪进行扫描、分析。结果判定参照文献[8,9], 使用组织化学评分(H-score)分析方式对染色比例和染色强度进行评分, 其评分公式为H-score=∑(PI×I)。其中I代表染色强度，分别为0(蓝色, 即未着色)、1(浅黄色)、2(深黄色)、3(棕色), PI代表不同染色强度的比例, 为0～100%。每张切片取5个×400镜下视野进行评分, 取平均值作为最终评分。

1.6 统计学方法

使用SPSS17.0对实验数据进行统计分析，结果均采用±s表示，组间差异比较使用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 日常行为观察及行为学指标比较

实验初期，实验组大鼠经旁观电击后主要表现为惊恐，频繁出现挖掘垫料钻入等躲避行为; 当电击进行到第5日左右时，实验组大鼠开始表现出敏感、高度警觉、易怒，被触碰背部时竖毛、转头, 攻击性增强, 抓取时挣扎剧烈; 实验后期，实验组大鼠抗拒情绪减弱，攻击性、反应性降低，主要表现为蜷卧，双眼无神，毛色杂乱无光泽。对照组大鼠在整个实验干预期间表现正常。旷场实验结果如表1所示。实验组大鼠在旷场中的移动路程与对照组大鼠相比显著降低(P＜0.05)，在旷场中部的活动路程及停留时间显著增加(P＜0.05)。

2.2 体质量增加及血压指标比较

与对照组相比，实验组大鼠的体质量增加显著降低(P＜0.05)(表2)。实验组大鼠的收缩压指标于实验进行第5日后检测时已出现较为明显的上升, 但尚未表现出统计学意义(P＞0.05)。随着干预天数的增加, 实验第10日和第15日检测时, 实验组大鼠的血压数据进一步升高, 与对照组大鼠相比差异有统计学意义(P＜0.05)(表2)。

2.3 NF-κB 表达比较

2.3.1 NF-κB p65 mRNA表达比较 实时荧光定量PCR目的基因NF-κB p65和内参GAPDH的标准曲线线性良好，引物扩增效率为99.8%。将对照组大鼠肝细胞NF-κB p65的表达水平定为1，实验组大鼠的基因表达量约为对照组的5.45倍(P＜0.05)。

2.3.2 NF-κB p65 蛋白表达比较 蛋白表达通过免疫组化检测, 使用H-score评分(0～300)进行半定量分析。结果显示, 对照组大鼠H-scores平均得分2.53±0.47, 实验组大鼠平均得分43.95±3.66(P＜0.01)。

2.4 部分免疫及内分泌指标比较

2.4.1 各组大鼠的部分免疫学指标 实验组大鼠的主要免疫器官系数均出现一定程度的下降，但与对照组大鼠相比差异无统计学意义(P＞0.05)，而血清IL-2的水平则显著低于对照组(P＜0.05)(表3)。

2.4.2 各组大鼠的部分内分泌指标 实验组大鼠的EPI和NE水平均高于对照组, 且差异有统计学意义(P＜0.05)，同时实验组大鼠的血清ACTH和CORT水平与对照组相比也都出现显著的升高(P＜0.05)(表 4)。

3 讨论

应激是生物机体在对生存环境中多种不利因素的适应过程中，实际的或者认知上的要求与现实适应能力两者之间的不平衡而导致的身心紧张状态及反应[10]。多种应激因素均可以对生物机体产生广泛而严重影响，导致不仅是生理，同时还有心理功能紊乱的应激损伤[11]。本研究选择了电击旁观这一经典方式进行单一干预，给予大鼠心理刺激，以对其心理健康造成影响，同时尽量减少对大鼠躯体的直接物理刺激。通过实验观察表明，实验进行第5日左右时，实验组大鼠表现出惊恐，易怒等状态，表明其受到了心理应激，并迅速进入了应激抵抗期，其竖毛，攻击性上升等表现都是对于外界刺激的一种防御性行为，时刻准备应对突发情况。随着干预时间的延长，实验组大鼠的主要表现逐渐转变为静卧, 精神萎靡, 被触碰时逃避、竖毛、转头等行为基本消失, 表明大鼠的应激反应已由抵抗转入衰竭，不能正常的应对外界刺激, 反应性下降，存在一定的应激障碍。行为学实验中, 实验组大鼠在旷场中行动速度降低, 路程减少, 于中部区域停留时间长，表明实验组大鼠怠动, 对外界反应灵敏性降低，探索行为减少, 活动性下降。

表1 旷场实验结果

表2 各组大鼠体质量增加和血压结果

表3 各组大鼠部分免疫指标结果

表4 各组大鼠部分内分泌指标结果

蓝斑-肾上腺髓质(LC/NE)系统和下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴(HPA轴)是生物机体应激反应的两条主要途径。其中LC/NE系统主要参与应激时的急性反应，但该系统的持续兴奋可引起明显的组织分解和能量消耗, 以及部分器官的缺血甚至坏死[12]。本实验中实验组大鼠血清EPI水平显著升高，提示该系统处于激活状态，可以使躯干肌肉充血，保证躯体的运动机能以应对危机。但消化系统平滑肌群的长期缺血会导致大鼠食欲下降, 摄食减少，再加上高EPI水平引起的强烈分解作用，必然使大鼠的生长、发育水平受到影响。这刚好与本文实验组大鼠血压水平显著高于对照组，体质量增加显著低于对照组的结果相印证，表明实验组大鼠LC/NE系统确实处于过度激活状态，已对大鼠的机体造成影响，损害了其福利水平。HPA轴是生物机体应对刺激的主要应激通路，其激活的主要表现为外周血ACTH和CORT水平显著升高。本实验中，实验组大鼠ACTH和CORT指标均显著高于对照组，提示实验组大鼠由于长时间心理应激导致HPA轴过度激活，使CORT的负反馈功能受到抑制甚至消失，外周血CORT水平持续上升。长时间的高CORT水平将改变机体的应激行为、内分泌及免疫活动，对机体产生不利影响[13,14]。IL-2是一种重要的免疫调节因子，是机体细胞免疫功能的重要指标，同时具有重要的中枢调节作用[15,16]。本实验中，实验组大鼠的IL-2水平显著降低也极有可能是由于长时间的高CORT水平引起的免疫抑制作用，使其免疫功能受到了负面影响。

近年来，一些研究者尝试将应激蛋白引入实验动物福利研究中，比如热休克蛋白以及本文提及的NF-κB等。NF-κB调控范围广泛，同时能够引起其活化的因素也有多种，应激也是其中一种重要因素[17,18]。本次实验中, 对照组大鼠的NF-κB蛋白H-scores评分为2.53±0.47, 仅本底表达, 而实验组大鼠的评分显示其NF-κB表达水平显著提升。虽然影响NF-κB的因素众多, 但本实验中饲养条件均一,实验干预相对固定, 可以确定心理应激就是引起实验组大鼠NF-κB表达水平上调的唯一原因。考虑由于干预方式单一, 干预时间也较短，所以NF-κB表达水平仅低度上调，如果干预方式更为激烈并增加干预时间，预计NF-κB极可能表现出更为剧烈的变化。由此可见，旁观电击的负面感官刺激和社群交流作为应激源导致了实验组大鼠心理应激状态的产生，同时导致了实验组大鼠NF-κB p65的mRNA水平上升，蛋白表达上调，并伴随其他福利相关指标的变化。该结果提示NF-κB与实验动物福利水平之间具有一定关联，但其表达变化与其他福利相关指标(如IL-2、ACTH以及CORT等)变化之间是否存在相关性，尚有待进一步实验论证。

许多科研人员在实验中都能够注意到目标动物的福利问题，但往往却忽视了实验过程对其他动物的负面感官刺激。综合本次实验结果，表明负面感官刺激可导致大鼠的心理应激，心理福利受损，整体福利水平下降，主要表现为：大鼠外观萎靡，毛色差，冻结行为增加，对外界刺激敏感性降低；应激蛋白NF-κB表达水平上调，大鼠机体长时间处于应激状态; 食欲下降，生长受限，体质量增加显著减少; 主要免疫器官有萎缩趋势，IL-2指标显著降低，整体细胞免疫水平下降，呈现一定程度的免疫抑制，机体疾病易感性上升; 外周血CORT、EPI等多项指标出现显著变化，并伴随自主反馈机制失灵，呈现一定程度的内分泌紊乱。在动物实验中，实验人员应重视负面感官刺激造成的应激，实验干预时注意隔离, 尽量降低此类刺激对实验过程的影响, 以免造成实验结果的偏差[19]。

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