正常成年雄性食蟹猴部分免疫功能指标观测

韦 毅, 符明泰, 阳 明, 黄卫宣, 蓝 娇, 覃喜军, 玉 宁

(1.防城港常春生物技术开发有限公司, 防城港538038;2. 广西壮族自治区人民医院科研实验中心, 南宁 530021;3. 南宁维尔凯生物技术有限公司, 南宁 530021)

食蟹猴(Macaca fascicularis)是独具特色与优势的实验动物资源, 近年来已广泛应用于人类疾病发生机制、药理学以及新药临床前安全性评价等研究领域中, 是目前国内外使用量最大的非人灵长类实验动物[1,2]。国内有关食蟹猴血液、生化等生物学指标及正常值报道很多, 而有关正常食蟹猴的免疫功能指标的报道很少。本文对正常成年雄性食蟹猴的部分免疫功能指标进行了测定, 旨在为实验食蟹猴的应用与免疫相关疾病的动物研究提供一些参考数据。

1 材料与方法

1.1 动物

原种引自越南野生食蟹猴, 经人工繁育的第3代成年雄性食蟹猴, 共36只, 体质量3.5±0.5 kg, 年龄3～5 (3.8±0.8)岁, 广西壮族自治区防城港常春生物技术开发有限公司提供[SCXK (桂)2013-0004], 所有动物均为无外观缺陷和行为异常, 并按相关检验检疫标准确认为合格的普通级动物。饲养条件: 所有食蟹猴均按照野生动物饲养管理技术规程(LY/T, 食蟹猴), 分单笼饲养于不锈钢笼具内(笼具规格90 cm×90 cm×70 cm); 温度23℃左右; 相对湿度40%～60%;噪声≤60 dB; 换气次数10次/h; 明暗12 h/12 h(8∶00～20∶00); 每日饲喂猴颗粒饲料3次, 自由饮水, 并辅以清洁水果。适应性饲养60 d后用于实验。

1.2 仪器设备与试剂

全自动血细胞计数仪(日本希森美康公司,XN-21)、日立7600全自动化分析仪(日本日立公司)、FACS Calibur 流式细胞仪(美国BD公司)、淋巴细胞亚群检测试剂盒(美国Becton Dickinson 公司)、细胞因子[γ-干扰素(IFN-γ)、白介素 -2(IL-2)、白介素-5(IL-5)、白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)、白介素-18(IL-18)]检测试剂盒(美国BD公司)、Immage800特定蛋白仪(美国Beckman Coulter公司)。

1.3 方法

早上在动物空腹、清醒状态下，通过笼具配套装备固定食蟹猴，由专人每周三上午9∶00抽取动物后肢大隐静脉血用于检测相关指标。

1.3.1 血液学常规检测 取抗凝血2 mL, 按照全自动血细胞计数仪以及试剂盒操作规程进行以下指标测定: 白细胞计数 (WBC)、淋巴细胞计数(LY)、淋巴细胞比值 (LY%)、单核细胞计数 (MONO)、单核细胞比例(MONO%)、中性粒细胞计数(NEUT)、中性粒细胞比例 (NEUT%)。

1.3.2 T淋巴细胞亚群检测 取抗凝血2 mL与CD3-FITC、CD4-P、CD8-APC单克隆荧光抗体混匀, 避光反应15 min, 然后加入1×裂解缓冲液, 300×g离心5 min，PBS洗涤细胞，应用FACS Calibur 流式细胞仪按照CBA法进行CD3+ 、CD4+、CD8+细胞表型检测。

1.3.3 细胞因子检测 取血清50 μL, 应用FACS Calibur 流式细胞仪按照CBA法进行IFN-γ、白细胞介素(IL-s)包括IL-6、IL-5、IL-2、IL-10、IL-18等因子检测。300 μL 检测稀释液作为阴性质控管(0 ng/L)。

1.3.4 免疫球蛋白、补体检测 取血清500 μL，应用美国贝克曼库尔特Immage800特定蛋白仪按照免疫散射比浊法对血清中免疫球蛋白IgG、IgA、IgM及补体C3、C4进行检测。

1.3.5 统计学分析 用SPSS 17.0统计软件对实验数据进行正态分布检验、分析，结果以x-±s表示，采用t检验比较组间差异，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血液学指标测定

如表1所示, WBC、LY、MONO绝对值较为稳定, 3次检测结果间差异无统计学意义; 而第3周NEUT绝对值比第1周、第2周分别下降了15.24%、13.89%(P＜0.05)。

2.2 T淋巴细胞亚群指标测定

从表2中可以看出，成年食蟹猴T细胞在淋巴细胞中所占比例在第2周分别比第1周、第3周高17.86%和12.11% (P＜0.05); Tc在T细胞中所占的比例则随检测周次呈逐渐上升趋势，但上升幅度较小(P＞0.05)。结果显示正常成年雄性食蟹猴的T淋巴细胞亚群测值较为稳定。

表1 食蟹猴血液学指标

2.3 細胞因子指标测定

如表3所示，IFN-γ、IL-10和IL-18三次检测均未检出; IL-5、IL-6表达量较低，3次检测结果间差异无统计学意义; 而IL-2表达量较高，但三次检测值间差异无统计学意义。

2.4 免疫球蛋白、补体测定

正常成年雄性食蟹猴体内的IgG呈高表达，但各相关抗体蛋白及补体均稳定，3次检测结果间无统计学意义(表4)。

表2 食蟹猴血液免疫学指标

3 讨论

食蟹猴广泛应用于免疫学、药理学、毒理学、药物安全性评价等方面的实验研究。然而，目前国内关于实验用食蟹猴的各种生物学指标仍缺乏一致性的共识，尤其在免疫功能指标检测方面更是匮乏[3,4]。为此, 本研究结合本实验室其他科研项目同步进行，旨在进一步补充完善该领域的实验研究基础数据，并建立本实验室的相关基础数据库。

表3 食蟹猴血液细胞因子的表达

表4 食蟹猴免疫球蛋白、补体指标

机体免疫系统是一个由免疫器官、免疫细胞及免疫活性因子组成的极其复杂的网络系统，通过固有性和适应性免疫应答两种作用机制发挥免疫功能。其中，机体的适应性免疫状况可以从体液免疫和细胞免疫两个方面来衡量，T、B淋巴细胞分别是细胞免疫、体液免疫的主要负责细胞。本实验成年雄性食蟹猴血液学检测结果与国内有关报道基本一致[4]。

通过测定D4+ CD8+的比值可以对机体细胞免疫功能进行评价，其比例的高低与免疫系统损害的程度具有相关性[5,6]。本次检测结果显示，成年雄性食蟹猴T/LYM比例为(42.97±14.50～60.83±8.99)%，Th/T为(36.02±10.58～41.66±9.81)%，Tc/T为(49.64±9.23～55.35±8.10)%。其与黄秋香等[3]的研究结果部分一致。另一方面，负责体液免疫的细胞是B细胞，其通过产生特异性抗体而起作用，其中 IgG、IgA、IgM是介导体液免疫的主要效应分子，因此抗体水平是反映体液免疫状态的重要指标。本实验结果显示，成年雄性食蟹猴血清中抗体蛋白IgG呈明显高表达，与李岩等[4]的报道有一定差异，IgM的含量测定值则基本一致。

参与免疫反应的细胞因子主要有IFN、IL-s、集落刺激因子、肿瘤坏死因子和转化生长因子等五大类[7,8]。本实验分别对IFN-γ、IL-6、IL-5、IL-2、IL-10、IL-18等部分因子进行了检测，结果显示: 在正常成年雄性食蟹猴中, 未能检出IFN-γ、IL-10、IL-18; IL-6、IL-5呈低表达; IL-2检测结果显示其表达量较高, 为(3.38±1.62～5.54±1.75) ng/L。所有检测指标表达均较为稳定，3次检测值间无统计学意义。

本实验结果显示, 正常成年雄性食蟹猴中可检出C3、C4补体成分，两者表达均较为稳定, 3次检测值间的差异无统计学意义。

本实验大部分检测结果与文献[9]基本一致，部分则有一定差异，这可能与动物种群、地域、环境如笼养方式以及实验检测条件等因素的影响有关。尽管本实验样本量较少且未进行性别年龄比对，但检测结果显示除血液学部分指标有所波动之外，其余指标多次测值均无显著性差异，说明实验重复性较好、结果较为可靠，可为食蟹猴免疫疾病模型建立、免疫疾病新药物临床前安全评价等相关研究工作提供免疫学方面的基础数据参考。

[1]石巧娟, 李巍, 萨晓婴, 等. 食蟹猴在医学研究中的应用进展[J]. 实验动物与比较医学, 2012, 32(4):358-365.

[2]高建峰, 滕利, 周立, 等. 恒河猴和食蟹猴在结核病研究中的应用进展[J]. 实验动物学, 2014, 31(6):51-54.

[3]黄秋香, 孙建华, 秦秋平, 等. 食蟹猴外周血淋巴细胞亚群的流式法分析验证和正常参考值测定[J]. 检验医学与临床, 2015 (A02):75-78.

[4]李岩, 何君, 孙井江, 等. 实验用食蟹猴生物学指标的研究[J]. 现代预防医学, 2010, 37(13):2503-2505.

[5]刘秀华, 王显波. 食蟹猴的实验室检查[J]. 黑龙江畜牧兽医, 2000(4): 22.

[6]许艳丽, 杜庆华. 流式细胞仪检测健康儿童T 淋巴细胞亚群及其绝对计数的研究[J]. 中华现代儿科学杂志, 2005, 2(7):591-592.

[7]Janssen EM, Droin NM, Lemmens EE, et al. CD4 + T-cell help controls CD8 + T-cell memory via TRAIL-mediated activation-induced cell death [J]. Nature, 2005, 434(7029):88-93.

[8]Bevan MJ. Helping the CD8+ T-cell response [J]. Nat Rev Immunol, 2004, 4(8):595-602.

[9]李伟, 金益, 柏熊, 等. 单笼与群居饲养对雌性食蟹猴生理指标的影响[J]. 实验动物与比较医学, 2016, 36(5):369-373.