兔斯氏艾美耳球虫环介导等温扩增技术检测方法的建立

温福利

(福州总医院比较医学科，福州 350025)

兔球虫病是由艾美耳属多种球虫引起的高度感染性、多发性原虫病, 主要寄生于家兔肝胆管或肠上皮细胞。实验兔感染后常出现消瘦、贫血等症状, 严重时会导致死亡[1]。在所报道的兔球虫中, 斯氏艾美耳球虫Eimeria stiedai(E.stiedai)是致病力最强、危害最为严重的兔球虫之一[2]。幼兔接种104个E.stiedai孢子化卵囊，其死亡率可达到40%, 接种105个卵囊, 其死亡率能够达到80%[3], 是我国兰州、重庆、福建等地区兔场流行的优势虫种[4-6]。

兔球虫的检测主要采用直接压片法或饱和盐水漂浮法，但存在误检、漏检现象。核酸检测技术具有高度敏感性和特异性，在医学、食品科学等众多领域得到广泛应用。环介导等温扩增技术(Loop-mediated amplification, LAMP)是近些年兴起的一项新型核酸检测技术[7], 因其特异性强、灵敏度高及检测过程快速准确等特点被广泛应用于生物学的各个领域。目前, 未见应用环介导等温扩增技术检测E.stiedai的报道。本实验根据E.stiedai的ITS1-5.8sRNA-ITS2基因序列设计特异引物(GenBank: JQ328190.1), 通过优化反应条件，建立E.stiedai的LAMP检测方法，为E.stiedai的快速诊断奠定基础。

1 材料与方法

1.1 虫种来源

E.stiedai大型艾美耳球虫(E.magna)和巨型艾美耳球虫(E.maxima)由中国农业大学索勋课题组提供。鸡柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)由福建农林大学殷光文课题组提供。

1.2 仪器和试剂

质粒构建相关试剂及试剂盒(上海生工生物有限公司); DNA恒温扩增试剂盒(广州迪奥生物科技有限公司); H6-1微型电泳槽(上海精益有机玻璃制品仪器厂); FR980凝胶成像系统(上海复日科技有限公司); SMA4000微量分光光度计(merinton); PCR反应扩增仪(美国，Bio-Rad公司); LightCycler480荧光定量PCR仪(瑞士, 罗氏)。

1.3 DNA的提取

分别将106个卵囊和2 000个卵囊置于含磁珠的振荡器震荡20 min，然后按照植物基因组DNA快速抽提试剂盒说明提取DNA，-20℃保存。

1.4 重组质粒的构建与定量

以上述提取的卵囊 DNA 为模板, 加正向引物:5'-TGGCTTTCGCCAACCAACAT-3'和反向引物:5'-CTGCCTGCGCCAGTAGTAAC-3', 于 25 μL 反应体系中进行PCR 反应。反应条件为: 95 ℃, 预变性3 min; 94 ℃, 变性 30 s; 57 ℃, 退火 30 s; 72 ℃, 延伸30 s, 共35个循环, 72 ℃延伸5 min, 扩增片段为261 bp。将扩增片段回收后与pMD18-T载体进行连接, 转化DH5α 感受态细胞, 构建含ITS1-5.8sRNAITS2 目标片段的 pMD18-T-E.stiedai重组质粒。根据公式计算出pMD18-T-E.stiedai质粒拷贝数[8]。

1.5 引物的设计和合成

根据E.stiedaiITS1-5.8sRNA-ITS2基因序列(GenBank: JQ328190.1)，利用LAMP Designer LP110InstallerWin 32软件设计LAMP检测方法所需的内引物(FIP/BIP)、环引物(LP/LF)和外引物(F/B)(表1)。上海生工生物工程有限公司合成实验所需的引物序列。

表1 LAMP检测E.stiedai所需的引物序列

1.6 LAMP检测E.stiedai方法的建立

1.6.1 Bst聚合酶添加量的优化 研究Bst聚合酶对LAMP反应扩增效果的影响。本试验设置5个Bst添加量, 分别是0.5 μL、0.75 μL、1.0 μL、1.25 μL和1.5 μL, DNA模板(构建的重组质粒)75 ng, 内引物0.8 μmol/L, 外引物 0.15 μmol/L, 环引物 0.6 μmol/L,反应液RM(2×)12.5 μL, 其余用双蒸水补至25 μL。63 ℃反应1 h。根据扩增效果确定最适的Bst聚合酶添加量。

1.6.2 DNA模板添加量的优化 研究DNA模板对LAMP反应扩增效果的影响, 本试验设置5个DNA模板(构建的重组质粒)添加量, 分别是25 ng、50 ng、75 ng、100 ng 和 125 ng，Bst聚合酶1.5 μL，内引物0.8 μmol/L，外引物0.15 μmol/L，环引物0.6 μmol/L，反应液RM(2 ×)12.5 μL，其余用双蒸水补至25 μL。63 ℃反应1 h。根据扩增效果确定最适的DNA模板添加量。

1.6.3 LAMP引物浓度的优化 研究引物浓度对LAMP反应扩增效果的影响，本试验设置环引物、外引物、内引物各5个浓度，依次是0.2 μmol/L、0.4 μmol/L、0.6 μmol/L、0.8 μmol/L和1.0 μmol/L,0.05 μmol/L、0.1 μmol/L、0.15 μmol/L、0.2 μmol/L和0.25 μmol/L, 0.4 μmol/L、0.7 μmol/L、1.0 μmol/L、1.3 μmol/L和1.6 μmol/L。25 μL的反应体系，Bst聚合酶 1.5 μL，DNA模板(构建的重组质粒) 75 ng，反应液RM(2×)12.5 μL，依次优化环引物、外引物、内引物的浓度，其余用双蒸水补足，63℃反应1 h。根据扩增效果确定最适引物浓度。

1.7 特异性和敏感性试验

E.magna、E.maxima和E.tenella的DNA 模板作为阴性对照, 双蒸水作为空白对照, 检验E.stiedai上述两种检测方法的特异性。用1个、5个、10个、25个、50个E.stiedai卵囊的DNA样本及梯度稀释的重组质粒检验方法敏感性。

对2 000个E. stiedai卵囊的DNA提取液20 μL(原液)进行稀释: 1个卵囊=DNA原液0.5 μL+稀释液24.5 μL, 取混合液0.5 μL作DNA模板; 5个卵囊=DNA原液 0.5 μL+稀释液 4.5 μL, 取混合液0.5 μL作DNA模板; 按此稀释方法得到10个卵囊、25个卵囊和50个卵囊DNA模板各0.5 μL。

1.8 重复性实验

使用pMD18-T-E.stiedai质粒，做3个梯度的稀释，每个梯度重复3次，检测方法重复性。

2 结果

2.1 LAMP扩增E. stiedai的检测

以E.stiedai的重组质粒为模板, 63 ℃反应1 h，加入显色液后，阴性对照呈浅橙色，LAMP扩增E.stiedai的产物呈绿色，说明可以用LAMP的方法扩增E.stiedai的核酸(图1)。

2.2 LAMP反应条件优化

在其他条件相同时, Bst聚合酶添加量是1.5 μL时，扩增曲线的出现时间最早(图2A); DNA模板的添加量是75 ng或125 ng时，扩增曲线的出现时间基本一致，为降低成本，DNA的最佳添加量是75 ng(图 2B)。

在其他条件相同时, 环引物浓度为0.8 μmol/L时, 扩增曲线出现的时间最早(图3A); 内引物浓度为1.6 μmol/L 时, 扩增曲线出现的时间最早(图 3B); 外引物浓度为0.15 μmol/L时, 扩增曲线出现的时间最早(图3C)。故LAMP扩增E.stiedai的环引物、内引物及外引物的最佳浓度依次是0.8 μmol/L、1.6 μmol/L和 0.15 μmol/L。

2.3 敏感性和特异性检测

图2 Bst聚合酶和DNA模板对LAMP扩增的影响

将E.stiedai卵囊 DNA(3.6× 108拷贝数/μL)进行10倍系列的稀释，重组质粒最低检测限为36拷贝数/μL(图4A)。E.stiedai的DNA样本出现扩增曲线，E.magna、E.maxima和E.tenella的DNA样本未见扩增曲线(图4B)。对特定个数E.stiedai卵囊检测发现，最低检测限为10个E.stiedai卵囊DNA的样本(图 4C)。

2.4 重复性试验检测

用同一模版进行梯度稀释，每个稀释的样品做3次，结果表明，变异系数＜2%，说明该LAMP方法的重复性好(表2)。

3 讨论

LAMP方法已广泛应用于病毒、寄生虫、食品致病菌等众多领域的检测研究。Kil等[9]成功建立了番茄黄病毒(Tomato chlorosis virus)的LAMP检测方法，最优的反应体系中含2U Bst DNA 聚合酶和4 mmol MgSO4，60～62 ℃反应 1 h。Yuan 等[10]建立了兔出血症病毒的LAMP检测方法，该方法的灵敏度比普通PCR方法高100倍。Fallahi等[11]采用巢式PCR和LAMP方法检测弓形虫(T. gondii)，结果表明LAMP方法的灵敏性高于巢式PCR，LAMP作为检测弓形虫的方法具有很大的优越性。LAMP方法可以简单有效地检测泰国肝吸虫(O. viverrini)[12]和人血样中的利士曼原虫[13,14]，同时也是检测疟疾的一个强有力的分子诊断工具[15]。

图3 引物浓度对LAMP扩增的影响

图4 LAMP法检测E. stiedai和其它球虫卵的结果

表2 重复性试验结果

目前，市场上还没有控制兔球虫病的特效疫苗[16], 药物治疗和环境消毒是主要的防治措施[17]。定期检测兔球虫的感染情况可及时发现和有效防治兔球虫病。因此，建立E. stiedai有效快速的诊断方法显得尤为重要。

LAMP反应的效率较高，但在研究过程中需要正确操作，否则容易造成气溶胶污染，影响检测效果。此外, 该方法对引物设计要求较高，需要验证引物是否能特异性地扩增目的基因。本研究针对E.stiedai的ITS1-5.8sRNA-ITS2基因序列设计6条引物，对LAMP反应中Bst聚合酶、DNA模板的浓度及环引物和内、外引物浓度进行了优化。结果表明, 25 μL的反应体系中: Bst聚合酶的最优添加量是1.5 μL, DNA的最优添加量是75 ng, 环引物、内引物和外引物的最优浓度依次是0.8 μmol/L、1.6 μmol/L 和 0.15 μmol/L，在63 ℃反应1 h 后，能特异地扩增目的基因。对提取的重组质粒进行10倍系列稀释，能够检测到36拷贝数/μL的DNA样本，表明该方法具有较高的敏感性。同时，对E.maxima、E.magna、E.tenella卵囊的DNA样本进行检测后未见扩增曲线, 表明建立的LAMP检测方法具有较好的特异性。本方法的建立可为E.stiedai的防治提供技术支撑，具有一定的应用价值。

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