高效液相色谱法检测生物体内羟基喜树碱的方法学研究*

★ 双若男 平欲晖*

(江西中医药大学药学院 南昌 330004)

羟基喜树碱属植物来源类一种天然抗癌药，具有活性高、抗瘤谱广等特点，它对肝癌、宫颈癌、胃癌、直肠癌等均有很好的效果[1-2]。高效液相色谱法(HPLC)可对药物进行定量定性的检测，且具有选择性好、灵敏性高的特点。本文采用高效液相色谱法检测羟基喜树碱在生物基质中的含量，并依据《中国药典》第四部9012生物样品定置分析方法验证的指导原则对方法的特异性、线性与范围、定量限、精确度与回收率等进行验证[3-4]。结果表明，该方法准确度高，回收率及稳定性好。结论HPLC方法能够高效检测生物基质中羟基喜树碱的含量。

1 仪器与试剂

电子分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；waters液相色谱仪(苏州市莱特科学仪器有限公司)；超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；电动离心机(上海安亭科学仪器厂)；涡旋仪(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；自动三重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂)。

甲醇(西陇科学股份有限公司，色谱纯)；三氯甲烷(国药集团化学试剂有限公司，分析纯)；磷酸二氢钾(天津恒兴化学试剂制造有限公司)；羟基喜树碱(陕西慈缘生物技术有限公司)；喜树碱(陕西冠捷科技有限公司)；胆固醇(上海艾韦特医药科技有限公司)；大豆卵磷脂(沈阳天峰生物制药有限公司)；肝素钠(上海蓝季生物)；生理盐水(江西科伦药业有限公司)。

2 血浆及各组织中羟基喜树碱(HCPT)含量测定方法

2.1 标准品的配制及生物样品的前处理

2.1.1 储备液的配制 标准溶液的配制：精密称取羟基喜树碱粉末2.417mg置于25mL容量瓶中，用甲醇超声溶解定容至刻度，使成0.09668mg/mL的标准储备溶液。储存于-4 ℃冰箱中，需要时采用甲醇稀释即可。

内标溶液的配制：以喜树碱为内标，精密称取喜树碱粉末1.07mg置于10mL容量瓶中，用甲醇超声溶解并定容至刻度，使成0.0107mg/mL的标准储备溶液。储存于-4 ℃冰箱中，需要时采用甲醇稀释即可。

NaOH(pH=12)溶液的配制：精密称取NaOH固体0.4g,蒸馏水溶解后置于1000mL的容量瓶，定容至刻度即得。

0.1mol/mL的NaOH溶液的配制：精密称取NaOH固体4g,蒸馏水溶解后置于1000mL的容量瓶，定容至刻度即得。

PBS(pH=6.5)缓冲液的配制：精密称取磷酸二氢钾6.8g置于1000mL的容量瓶，加入0.1mol·mL-1的NaOH溶液152mL，用蒸馏水定容至刻度即得。

2.1.2 血浆样品和组织样品的前处理 血浆的处理：眼眶取血置于加有1 %肝素钠离心管中，涡旋30 s，以13000 r/min离心10min，取上清液0.2mL，加甲醇0.8mL沉淀蛋白，涡旋30s，13000 r/min离心10min，取上清液待分析。

组织的处理：取心，肝，脾，肺，肾用生理盐水漂洗残留血，滤纸吸干水分，精密称定每一脏器组织的质量，用生理盐水制备成1∶2的各组织匀浆，涡旋30s，13000r/min离心10min，，取上清液0.2mL，加甲醇0.8mL沉淀蛋白，涡旋30s，超声3min，13000r/min离心10min，取上清液待分析。

2.1.3 羟基喜树碱脂质体的制备 薄膜分散-超声法：称取处方量的HCPT、TET、大豆卵磷脂、胆固醇溶于氯仿中，置于500mL圆底烧瓶，50℃、800mbar 减压蒸发，90r·min-1旋转成膜，于40℃真空干燥箱干燥过夜，加入pH6.5 的磷酸盐缓冲液10mL，置60℃水浴中水化2.5h，取出后探头超声。

2.2 色谱条件 色谱柱：SinoChrom ODS-BP (250mm×4.6mm,5μm) 流动相：甲醇：水(50∶50) 柱温：25℃ 检测波长：380nm 进样量：10μL流速：1mL·min-1。

2.3 特异性 取6个不同来源小鼠的空白血浆和各组织(心，肝，脾，肺，肾)按照2.1.2的“血浆样品和组织样品的前处理”得到空白血浆和空白组织样品图；在空白血浆添加羟基喜树碱和喜树碱的标准液同法操作得到色谱图；小鼠尾静脉后的实际血浆色谱图。将三种操作的色谱图进行比较观察基质中内源性组分或样品中其他组分对代谢物的测量是否存在影响。

通过对生物样品基质中羟基喜树碱特异性的考察，得到HPLC色谱图，羟基喜树碱的出峰时间约11min，内标物喜树碱的出峰时间约16min。从图1中可以看出待测物及内标在其保留时间下空白血浆和各空白组织中内源性物质对待测成分及内标无明显干扰，可以忽略，且待测物和内标可以较好的分离，因此该方法具有很好的特异性。

2.4 线性范围与定量下限 精密量取羟基喜树碱标准溶液，用甲醇超声溶解，并分别加入等量内标，定容至刻度线，振摇混匀，得含羟基喜树碱1.010、2.010、5.030、10.05、20.11、 50.27g/mL的溶液。分别取上述标准溶液1mL，加入空白血浆和空白组织液100μL，按照"2.1.2"项下处理，用上述色谱条件进行测定，以羟基喜树碱峰面积与内标峰面积之比对浓度进行线性回归。取空白血浆或组织匀浆，加入一定量HCPT对照品，得到4μg·L-1样品，处理后，测定其峰高与噪音，以信燥比大于或等于10计算羟基喜树碱的最低定量限。

结果表明标准曲线线性关系良好，相关系数(r)在0.9957～0.9987之间，线性结果如表1。以信噪比大于或等于10计算，本法羟基喜树碱在血浆、心、肝、脾、肺、肾中的最低检测质量浓度分别为0.00202、0.00202、0.00404、0.00606、0.00404、0.00404μg·mL-1，其可以检测分析物的药代动力学研究。

2.5 方法与系统精密度 从标准曲线中选取高，中，低3个差异浓度。即选取浓度为50.27、20.11、1.01g/mL为质控样品。按“ 2.1.2”项下样品前处理方法，并加入内标溶液进行测定，1d内连续测定5次，计算日内RSD；连续测定5d，每天连续测定2次，计算日间RSD。

质控样品的日内精密度和日间精密度结果见表2。质控样品的日内精密度RSD在1.816%～4.4104%之间。日间精密度RSD在0.3%～12.38% 范围内。结果显示日内日间精密度均在可接受标准之内，可以用于空白血浆和空白组织中的分析物的准确测定。

(A)空白血浆和各空白组织；(B)空白血浆和空白组织添加分析物和内标(C)给药10min后的实测血浆样品和各组织样品；1羟基喜树碱；2喜树碱

分析物标准曲线方程相关系数(r)线性范围(μg/mL)心y=0.0489x+0.10110.99701.010-50.27肝y= 0.2107x- 0.18330.99571.010-50.27脾y= 0.1676x+ 0.55980.97801.010-50.27肺y= 0.1741x+ 0.090.99761.010-50.27肾y= 0.2063x+ 0.18580.99871.010-50.27血y= 0.2142x+ 0.22730.99781.010-50.27

2.6 回收率

2.6.1 提取回收率 取质控样品按“ 2.1.2”项下样品预处理方法，每个浓度配制5份样品并加入内标溶液，进样分析，求得待测物与内标物的峰面积之比。另取相同浓度的质控药品，不经处理，加入相同体积的内标。比较提取以后分析物的色谱峰面积与未经提取直接进样获得的色谱峰面积，考察羟基喜树碱的提取率。

2.6.2 方法回收率 取质控样品按“ 2.1.2”项下样品预处理方法，每个浓度配制5份样品并加入内标溶液，进样分析，将HCPT峰面积与内标物质峰面积之比代入回归方程，得HCPT测定浓度，以测定浓度与配制浓度之比计算方法回收率。

质控样品3种浓度的血浆和组织样品中HCPT的回收率结果见表3。

表2 分析物在空白血浆和各空白组织中的精密度(n=10)

表3 分析物在空白血浆和各空白组织中的提取 回收率和方法回收率(n=5)

2.7 稳定性 配置5份低、中、高各个浓度的质控样品。短期稳定性操作是将未经处理的质控样品在室温下存放4 h后再去处理检测。冻融稳定性操作是将处理后的质控样品冷冻后室温融化，共3次后测量。制备后稳定性操作是将处理好待分析的样品放在HPLC的自动进样器中半天后测量。按上述色谱条件下进行测定，分别进样，记录色谱峰。

样品在室温下放置4 h期间没有观察到血浆和组织中分析物的浓度的显著差异，浓度百分比为99.02%～101.33%，RSD为0.19%～7.91%。完成三个冷冻和解冻循环后，浓度百分比为98.05%～102.19%，RSD为0.19%～8.21%，加入血浆和组织的分析物的浓度不受冷冻和解冻试验的显着影响。分析物在血浆和组织中无明显的降解，稳定性良好。

2.8 含量测定 羟基喜树碱脂质体，以 2.5mg/kg 小鼠尾静脉，注射药物10 min后摘眼球取血，并立即处死取小鼠组织(心、肝、脾、肺、肾)，按照“2.1.2”项下方法处理，加入内标溶液进行测定。

计算给药后小鼠肝脏、心脏、脾脏、肺脏及肾脏组织中羟基喜树碱的含量。结果见表4。

表4 样品含量测定结果表

3 讨论与小结

本实验采用高效液相色谱法(HPLC)，利用其较好的选择性、较高的灵敏性的特点，对药物在生物样品基质中进行检测。建立了羟基喜树碱在生物基质中分析方法，高、中、低浓度的方法回收率均大于98%，平均提取回收率均大于70%，日内、日间精密度均小于10% ，符合分析的要求，且方法专属性较好。根据本课题前期工作研究[5]，得到羟基喜树碱脂质体制备方法。实验中采用外标法检测时，回归方程线性关系较差，且数据不稳定，改用以喜树碱为内标的内标法后，线性关系明显改善且数据稳定可靠，且与羟基喜树碱得到较好的分离。故本实验可运用于动物体内药动学研究，同时也为羟基喜树碱的体内监测提供一种有效的手段。

[1]林隆泽,宋纯清,徐任生,等. 抗癌新生物碱11-羟基喜树碱[J].科学通报,1979(10):478-479.

[2]赵志英, 谢俊, 刘文一,等. 羟喜树碱脂质体的制备及其大鼠体内组织分布的研究[J].中国中药杂志, 2011, 36(4):450-454.

[3]王荣兵, 何剪太. 高效液相色谱法测定生物样品中ON01910.Na的含量[J].中国现代医学杂志, 2014, 24(20):31-36.

[4]国家药典委员会. 中华人民共和国药典[M].北京:中国医药科技出版社,2015: 363-368.

[5]王梦弟, 张宇, 翟玲燕,等. 星点设计-效应面法优化羟基喜树碱-粉防己碱复方脂质体的处方[J].科学技术与工程, 2017, 17(20):119-123.