快速溶剂萃取-凝胶净化-高效液相色谱法测定土壤中6种邻苯二甲酸酯

郭文建，张 慧，朱 晨，李红莉，岳太星，李洪霞，郭文波

1.山东省环境监测中心站，山东 济南 250101 2.山东大学环境科学与工程学院，山东 济南 250013 3.青岛国家海洋科学研究中心，山东 青岛 266071

邻苯二甲酸酯(PAEs)，又称酞酸酯，是一类人工合成可起软化作用的化合物，因其可显著提高塑料的可塑性和强度，被广泛用作增塑剂[1]。此外，它也可作为农药载体、驱虫剂、化妆品、润滑剂、去污剂的生产原料[2]。近年来，随着PAEs的大量生产和广泛使用，此类化合物在各种环境介质(如，空气、土壤、水体)中均被检测到[3]。已有研究表明，该类化合物具有内分泌干扰效应[4]，可通过呼吸、饮食、皮肤接触等进入人和动物体内，危害人类健康及生态环境[5]。目前，由PAEs引起的环境污染已经引起了广泛关注。美国环保署(US EPA)已将邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、二乙酯(DEP)、正二丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)、二辛酯(DNOP)、丁基苄基酯(BBP)6种PAEs列入了“优先监测污染物名单”，并制定了相应的土壤环境控制标准及土壤污染治理标准。中国也将DMP、DBP、DOP列入优先控制污染物黑名单[6]。此外，在2005年开始实施的全国土壤污染现状调查专项中，将PAEs列为土壤必测项目之一[7]。

气相色谱法(GC)、气相色谱-质谱法(GC-MS)[8-10]及液相色谱法(HPLC)[11-12]、液相色谱-质谱法(LC-MS)[13-14]是常用的PAEs分析检测手段。由于PAEs的高沸点特性使得应用GC或GC-MS时的难度增加，相比较而言，HPLC适用范围更为广泛，可用于大多数有机化合物的检测分析[15]。此外，要想准确测定环境介质中的PAEs，样品的前处理是必不可少的。索氏提取、微波萃取、超声萃取、快速溶剂萃取(ASE)等是常用的土壤样品前处理方法[16-17]。较其他方法而言，快速溶剂萃取法具有有机溶剂用量少，萃取速率快，回收率高等特点，在固体样品前处理方面表现出很好的应用前景。闫蕊[16]等对比了快速溶剂萃取法、索氏萃取法、超声萃取法下土壤样品中11种PAEs的回收率，以及萃取溶剂使用量、萃取时间等；结果发现，快速溶剂萃取法的回收率最佳、溶剂使用量最少、萃取速率最快，且萃取液的色谱峰干扰少，后2种方法仅对部分PAEs有萃取作用。

当前，文献中报道的PAEs检测方法多为单一PAEs的检测，并未考虑共存污染物的干扰。然而，实际的土壤基质中往往是多种有机污染物共存，在对样品萃取液采用液相色谱法检测时，其他共溶出的有机物往往会干扰PAEs的测定，从而使准确测定PAEs浓度的难度增加。因此，开发可准确测定含共存污染物土壤中PAEs浓度的方法很有必要。多环芳烃(PAHs)是可持续污染物(POPs)的一种，广泛存在于土壤中，且大多数的PAHs 在225 nm波长下均有吸收。因此，共存的PAHs可影响PAEs在其特征吸收波长(200、225、275 nm)下的响应，从而干扰PAEs的准确测定。本文重点是排除共存的PAHs对PAEs测定的干扰，为后续准确测定实际土壤样品中的PAEs提供思路。凝胶净化(GPC)是常用的土壤净化手段，各组分流经凝胶层析净化柱后，可按分子的大小依次被洗脱出来，采集相应时间段的洗脱液，进行后续检测。研究表明，经凝胶渗透色谱净化后，可有效去除土壤中共存污染物对16种PAHs的干扰，且具有好的回收率[18]。此外，在土壤中有机氯农药的测定方面，也得到了应用[19]。目前，还未有关于PAHs共存的情况下高效液相色谱(HPLC)法准确测定PAEs方法的报道。

研究首先通过ASE快速萃取出土壤中共存的16种PAHs与6种PAEs，而后进行凝胶净化，通过对洗脱液的分段收集，去除共存的PAHs对PAEs测定的干扰，从而达到准确测定土壤样品中6种PAEs的目的。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱仪(日本)，配二极管阵列(DAD)和荧光(FLD)检测器；ZORBAX Eclipse Plus C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱；ASE-350型快速溶剂提取仪(美国)，配34 mL萃取池；LC-Tech凝胶渗透色谱仪；Bio-Beads SX-3凝胶层析柱(500 mm×25 mm，粒径37～74 μm)；有机样品浓缩仪(瑞典)；分析天平(瑞士)；硅藻土(美国)；石英砂(美国)；6种邻苯二甲酸酯，16种PAHs，购自美国AccuStandard公司；二氯甲烷、丙酮、正己烷、环己烷、乙酸乙酯、乙腈均为色谱纯(美国)；实验用水为超纯水(美国)。

1.2 标准溶液

6种PAEs及16种PAHs的储备液浓度均为100 mg/L，准确称取一定量的标准物质，以乙腈为溶剂，配成储备液，于 4 ℃下保存。使用时，用乙腈逐级稀释储备液，得到不同浓度的标准混合溶液。

1.3 样品制备

空白加标，准确称取5.00 g石英砂，作为空白土壤样品，加入5 g硅藻土，混合均匀后置于34 mL ASE萃取池中，微量注射器加入一定量的标准混合溶液。

基体(样品)加标，准确称取去除杂质的新鲜土样5.00 g，加入5 g硅藻土，充分混匀、脱水，研磨至散粒状，作为实际土壤样品，置于34 mL ASE萃取池中，微量注射器加入一定量的标准混合溶液。土壤样品干物质测定按照《土壤 干物质和水分的测定 重量法》(HJ 613—2011)执行，样品定量分析时全部以干物质计算。

1.4 样品前处理

将制备好的土壤样品装入34 mL萃取池中，以二氯甲烷-丙酮(体积比为1∶1)为萃取溶剂进行萃取。萃取温度100 ℃，萃取体积为60%，萃取压力为1 500 psi，预热平衡5 min，静态萃取10 min，循环2次，氮气吹扫60 s，收集全部提取液，进入GPC三联机模式(预浓缩-净化-浓缩)。预浓缩参数：浓缩腔温度40 ℃，高真空度0.03 MPa，低真空度0.032 MPa。浓缩参数：浓缩腔温度40 ℃，真空度在0.018 MPa,低真空度0.2 MPa。洗脱溶剂为环己烷-乙酸乙酯(体积比为1∶1)，流速5 mL/min，进样量5 mL，收集12～28 min流出液，并浓缩至1 mL(溶剂置换为乙腈)，待分析。

1.5 色谱条件

色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18(150×4.6 mm，5 μm)色谱柱，柱温35 ℃，流速1.0 mL/min，进样量20 μL。流动相：水(A)-乙腈(B)。梯度洗脱程序：0～2 min，流动相B保持为55%；2～6 min，B相由55%线性升至100%，保持9 min；15～16 min，B流动相降为55%，维持2 min。定量波长为225 nm。

2 结果与讨论

2.1 ASE萃取溶剂的选择

二氯甲烷、正己烷、丙酮等是常用的PAEs的萃取溶剂。在US EPA 3500方法中采用正己烷-丙酮混合溶剂、二氯甲烷-丙酮混合溶剂提取固体样品中的PAEs，效果较好。实验对比研究了二氯甲烷-丙酮(体积比为1∶1)、二氯甲烷-正己烷(体积比为1∶1)、丙酮-正己烷(体积比为1∶1)3种萃取溶剂下PAEs的萃取效率，并筛选出最佳的PAEs萃取溶剂。回收率数据表明，经二氯甲烷-丙酮(体积比为1∶1)提取后，6种PAEs的回收率为90%～121.7%，优于其他2种溶剂的萃取效率(图1)。此外，经这3种混合溶剂快速萃取后，PAHs也被萃取出来，且3种混合溶剂作用下16种PAHs的萃取回收率几乎相同，依次为68.7%～122.1%、73.2%～119.0%、61.0%～109.0%。因此，实验选取二氯甲烷-丙酮(体积比为1∶1)作为土壤中PAEs的萃取溶剂。

注：3种混合萃取溶剂的体积比均为1∶1。图1 不同萃取溶剂对PAEs回收率的影响Fig.1 Effects of extraction solvent on the recovery of PAEs

2.2 GPC收集时间的确定

一般来说，实际的土壤样品中会含有多种有机污染物，在进行一般的提取处理时，共存污染物往往会同目标物一同萃取到溶剂相中，这可能会对后续目标物的准确定量增加难度。PAHs是可持续污染物的一种，广泛存在于土壤中。研究选定的色谱条件下对16种PAHs进行了液相-紫外检测分析，发现16种PAHs出峰时间在7.5～12.5 min时，会干扰DBP(9.4 min)和BBP(9.7 min)的测定。对比6种PAEs和16种PAHs的流出曲线发现，6种PAEs在28 min已经完全洗脱，而PAHs在26 min后，才开始有萘的洗脱(图2)。因此，准确测定这6种PAEs只需收集12～28 min的流出液，而此时间段的流出液即能够保证土壤中PAHs的有效去除，同时又能够保证被测组分的全部接收。

为验证经GPC净化后，16种PAHs对目标污染物测定的干扰得到了去除，分别对净化前的ASE萃取液和净化后的流出液(12～28 min)进行HPLC检测分析。取2份等量的空白土壤(石英砂)，分别与5 g硅藻土混匀，然后加入相同量的PAEs和16种PAHs标准混合溶液，经ASE萃取后，一份样品萃取液经直接浓缩、定容后进行HPLC检测分析(图3)。另一份样品萃取液进行GPC净化处理，收集12～28 min的流出液，此时间段流出液经浓缩、定容后进行检测分析(图4)。对比发现，经GPC净化处理后，16种PAHs的干扰得到了有效去除。这也说明，采用GPC通过收集不同时间段的流出液来去除PAHs对PAEs测定的干扰的思路是可行的。

图2 PAEs、PAHs的GPC流出曲线Fig.2 Outflow curves of PAEs and PAHs

图3 样品净化前色谱图Fig.3 The chromatogram before purification

图4 样品净化后色谱图Fig.4 The chromatogram after purification

2.3 方法的验证

2.3.1 校正曲线与检出限

取不同浓度的6种PAEs混合标准溶液(0.25、0.5、1.0、2.5、5.0 μg/mL)分别进样，以峰面积对浓度做线性回归分析。在选定色谱条件下，6种PAEs的线性关系良好，相关系数大于0.999 9。分析7个空白加标样品，计算标准偏差(S)。方法检出限计算公式如下：

MDL=t(n-1,0.99)S

(1)

式中：MDL为方法检出限，t(n-1,0.99)为置信度99%、自由度(n-1)时的t值。求得PAEs的方法检出限，4倍的检出限为其测定下限。如表1所示，6种PAEs的检出限为2.7～11.5 μg/kg,完全满足实际样品的定量分析要求。

表1 6种PAEs的线性方程与检出限Table 1 Linear equation and detection limits for the determination of six PAEs

2.3.2 方法精密度与准确度

对实验室空白加标样品进行方法精密度与准确度实验，其中，PAEs加标浓度为133 μg/kg；PAHs为66.7 μg/kg，经ASE和GPC后，在最佳色谱条件下，进行6次连续测定。由表2可见，6种PAEs浓度的相对标准偏差为4.23%～10.1%，回收率为76.2%～91.4%，满足检测需求。

表2 空白加标样品的回收率、精密度Table 2 RSD and recovery rate of blank spiked soil sample

2.4 实际样品分析

对底泥及表层土壤样品进行分析，2种土壤样品均有PAEs检出(表3)。对2种土壤样品进行了加标回收实验，其中，6种PAEs的加标浓度分别为66.7、133、267 μg/kg，16种PAHs的加标浓度为66.7 μg/kg。由表3可见，在底泥和表层土壤2种样品不同加标浓度下，样品的平均加标回收率为66.5%～102%，相对标准偏差为1.5%～9.5%。说明该方法稳定，回收率较高，具有实际应用价值。

表3 2种土壤样品中6种PAEs的测定值、加标回收率、相对标准偏差(n=6)Table 3 Determination, recovery rate and RSD of two soil samples (n=6)

3 结语

研究采用ASE对土壤中的PAEs进行提取，并过Bio-Beads SX-3凝胶层析柱净化，通过分段收集，消除了土壤中共存的16种PAHs在225 nm紫外波长下对6种PAEs测定的干扰。此方法的回收率为66.5%～102%，检出限为2.7～11.5 μg/kg，相对标准偏差为1.5%～9.5%。方法萃取效率高，精密度及检出限较好，可适用于含PAHs的土壤中PAEs的准确测定，具有较好的实际应用价值。

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