前列化浊丸对慢性非细菌性前列腺炎大鼠的干预机制研究

陈膺仲，宫小勇，郑 伟，薛超辉，李永强

(1.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046；2.陕西中医药大学第二附属医院泌尿外科，陕西 咸阳 712000)

前列腺炎是男性泌尿外科常见疾病之一，基于人群的调查估计，中国前列腺炎的发病率约为8.4%[1]。前列腺炎中最常见的类型是慢性非细菌性前列腺炎(chronic nonbacterial prostatitis，CNP)，大约占所有慢性前列腺炎的90%。CNP发病机制尚不清楚，临床症状多样，患者常表现为骨盆会阴区域疼痛难受、排尿不适、性功能障碍及全身症状等。目前研究发现，慢性前列腺炎与机体免疫密切相关，而相关细胞因子在慢性前列腺炎中的作用一直是近几年的研究热点[2]。本研究通过观察前列化浊丸对CNP大鼠白细胞介素2(interleukin 2，IL-2)、白细胞介素8(interleukin 8，IL-8)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)、白细胞介素10(interleukin 10，IL-10)的影响，探讨前列化浊丸治疗CNP的作用机制，为临床治疗CNP提供依据以及新的思路。

1 材料

1.1 实验动物 选取15周龄雄性、SPF级SD大鼠50只，体质量300～350 g，由西安交通大学医学部实验动物中心[生产许可证号：SCXK(陕)2012-003]提供，动物饲养房的温度控制在(23±3.0)℃，相对湿度为55%～66%，适应性喂养7 d。

1.2 实验药物 前列化浊丸(药物组成：蒲公英20 g，败酱草、赤芍各10 g，丹参、桃仁、川楝子、王不留行、红花、乳香、泽兰各6 g；由陕西中医药大学第二附属医院研发，药品批准文号：陕药制字Z20150029；规格：每瓶装36 g，每20丸质量约3 g);苯甲酸雌二醇注射液[批号 (2013)220412511]：四川金科药业有限责任公司。

1.3 实验试剂 IL-10 ELISA试剂盒(批号 70-EK3102/2)、TNF-α ELISA试剂盒(批号 88-7340)：武汉赛维尔生物科技有限公司；IL-8酶联免疫分析试剂盒：上海通蔚试剂有限公司。

1.4 仪器与设备 安图斯2010全自动酶标仪：上海拜格生物科技发展有限公司；HF-1200R高速冷冻离心机：上海江东仪器有限公司；UVS-1漩涡混匀器：南京科航仪器有限公司；ESJ30-5A精密电子天平：沈阳神宇龙腾天平有限公司。

2 方法

2.1 模型制备与给药 参照文献[3]复制动物模型，模型组，前列化浊丸低、中、高剂量组大鼠均经腹腔注射10%水合氯醛3 mL/kg对大鼠进行麻醉，并在麻醉后行去势手术，缝合切口并无菌操作后放回鼠笼，密切观察。于第2日在腹部皮下注射苯甲酸雌二醇0.25 mg/kg，每日1次，连续30 d。前列化浊丸低、中、高剂量组每日分别给予0.85、1.7、3.4 g/kg(分别相当于临床70 kg成人日用剂量的5、10、20倍)前列化浊丸溶液灌服；空白对照组给予生理盐水灌胃。按每100 g体质量给予药物溶液2 mL，持续灌胃30 d。

2.2 观察指标

2.2.1 大鼠前列腺组织病理改变 取大鼠前列腺组织，用4%多聚甲醛固定24 h后，经乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，连续切片5～6 μm，然后行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色，于光镜下观察各组大鼠前列腺组织形态学变化。

2.2.2 大鼠前列腺组织内白细胞数量 取大鼠前列腺组织，每1 mg加生理盐水4 μL并剪碎混匀。向试管内加入白细胞稀释液0.38 mL，然后用移液器吸取上述制好的标本20 μL，在试管稀释液底层轻轻放出，吹打3次混匀，充池，计数白细胞数目。

2.2.3 大鼠血清IL-2、IL-8水平测定 取大鼠腹主动脉血4 mL，静置30 min后用离心机以3 000 r/min离心15 min，制备血清1.5 mL，随后分别用IL-2、IL-8 ELISA试剂盒检测各组大鼠血清IL-2、IL-8水平。

2.2.4 大鼠前列腺组织TNF-α、IL-10水平测定 取大鼠前列腺组织，每100 mg加生理盐水1 mL，搅碎前列腺组织并放入混匀器中，制作前列腺组织匀浆。然后将组织匀浆用离心机以3 000 r/min离心15 min，取适量上清液，用TNF-α、IL-10 ELISA试剂盒检测各组大鼠前列腺组织中TNF-α、IL-10水平。

3 结果

3.1 各组大鼠前列腺组织病理形态学比较 空白对照组大鼠前列腺组织形态学无异常变化，腺泡腔内有粉色分泌物，间质内没有炎性细胞浸润、无血管充血扩张。模型组大鼠前列腺组织形态学变化明显，可见血管扩张充血，腔内分泌物减少，泡腔明显变小、狭窄，腺泡上皮呈现乳头状增生，间质疏松水肿、纤维化且可见大量淋巴细胞和浆细胞，表明动物模型复制成功。与模型组比较，前列化浊丸高、中、低剂量组大鼠前列腺炎性反应显著减轻，前列腺组织病变程度均有不同程度的改善。见图1。

注:A.空白对照组;B.模型组;C.前列化浊丸低剂量组;D.前列化浊丸中剂量组;E.前列化浊丸高剂量组图1 各组大鼠前列腺组织形态学比较(HE染色,10×10倍)

3.2 各组大鼠前列腺组织内白细胞数量比较 与空白对照组比较，模型组大鼠前列腺组织内白细胞数量明显增加(P<0.05)。与模型组比较，前列化浊丸低、中、高剂量组大鼠前列腺组织内白细胞数量均显著减少(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠前列腺组织内白细胞数量比较

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

3.3 各组大鼠血清IL-2、IL-8水平比较 与空白对照组比较，模型组大鼠血清IL-2和IL-8水平均显著上升(P<0.05)。与模型组比较，前列化浊丸低、中、高剂量组大鼠血清IL-2和IL-8水平均显著下降(P<0.05)。见表2。

3.4 各组大鼠前列腺组织TNF-α、IL-10水平比较 与空白对照组比较，模型组大鼠前列腺组织中TNF-α和IL-10水平均显著上升(P<0.05)。与模型组比较，前列化浊丸低、中、高剂量组大鼠前列腺组织中TNF-α和IL-10水平均显著下降(P<0.05)。见表3。

表2 各组大鼠血清IL-2、IL-8水平比较

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

表3 各组大鼠前列腺组织TNF-α、IL-10水平比较

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

4 讨论

CNP发病机制尚不清楚，临床症状多样，常表现为骨盆会阴区域疼痛不适、排尿不适、性功能障碍及全身症状等；某些患者因CNP迁延不愈甚至并发焦虑、沮丧、烦躁、抑郁等神经精神症状，严重影响患者身心健康及正常生活。

目前，国内外研究普遍认为CNP发病机制与细胞因子有关。细胞因子由炎性细胞和免疫细胞分泌产生，其参与CNP的发生和转归，与之密切相关[4]。邹如政等[5]研究发现，TNF-α可以刺激IL-8并进而促进前列腺炎的发生发展。吴伟燕等[6]研究发现，TNF-α含量升高导致人体疼痛超敏和自发性疼痛，这可能也是CNP患者骨盆会阴区域疼痛不适的潜在原因。IL-10由Th2辅助细胞亚群产生，能够抑制单核巨噬细胞对免疫介质的释放，减少IL-1和TNF-α的释放且降低其活性。李杰等[7]研究发现，患者精液中IL-10浓度与慢性前列腺炎症状评分呈正相关，患者精液中IL-10浓度越高，其疼痛症状就越重。IL-8是强效的炎症趋化因子，其主要作用是帮助诱导单核细胞及中性粒细胞进入炎症区域并且调节白细胞黏附分子表达[8]。尹静等[9]研究发现，IL-8能够尽早及更准确地反映CNP病情变化。IL-2能够促进T细胞增殖和分化，从而加重炎性浸润与损伤[10]。张亚强等[11]发现，慢性前列腺炎患者的前列腺液中IL-2含量较健康人明显增高。综上所述，IL-2、IL-8、TNF-α、IL-10与CNP的发生发展具有密切关系。因此，本实验通过检测CNP大鼠血清IL-2、IL-8水平以及大鼠前列腺组织中TNF-α、IL-10水平以评估前列化浊丸治疗CNP的疗效，并且探究其作用机制。

CNP可归属于中医学“精浊”“淋证”等范畴[12]，一般采用行气活血、化瘀止痛、清热利湿、导浊通淋等方法进行治疗。前列化浊丸中丹参、红花、赤芍、王不留行、乳香、泽兰、桃仁等活血化瘀，川楝子行气止痛，乳香活血化瘀，败酱草、蒲公英清热排毒、利尿散结，泽兰、王不留行活血化瘀、利尿通淋。

本实验采用前列化浊丸对去势后皮下注射苯甲酸雌二醇注射液导致的CNP大鼠进行干预。与空白对照组比较，模型组大鼠体内IL-2、IL-8、TNF-α、IL-10水平均显著升高(P<0.05)，说明动物模型存在炎性反应。与模型组比较，前列化浊丸低、中、高剂量组大鼠体内IL-2、IL-8、TNF-α、IL-10水平均有不同程度的降低(P<0.05)，说明经前列化浊丸干预后，治疗组大鼠前列腺炎性反应较模型组改善。此外，研究发现前列化浊丸可以有效降低CNP大鼠前列腺组织内白细胞数量，减轻间质疏松水肿及血管充血扩张，这提示前列化浊丸对CNP具有较好的治疗效果，其作用机制可能与抑制IL-2、IL-8、TNF-α等促炎性细胞因子的分泌有关。模型组大鼠体内的抗炎性细胞因子IL-10升高可能是为了抑制IL-2、IL-8、TNF-α等促炎性细胞因子的高表达，是机体为了维持细胞因子之间的平衡而发生的一种自身调节，因此各治疗组大鼠在接受前列化浊丸灌胃治疗后，体内IL-2、IL-8、TNF-α等促炎性细胞因子水平降低时，IL-10水平也随之下降，进而达到平衡状态。

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(收稿日期：2017-11-24；编辑：张倩)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effects of Qianlie Huazhuo Pill on interleukin-2 (IL-2), interleukin-8 (IL-8), tumor necrosis factor-α (TNF-α), and interleukin-10 (IL-10) in a rat model of chronic nonbacterial prostatitis (CNP) and the mechanism of action of Qianlie Huazhuo Pill in the treatment of CNP.MethodsA total of 50 specific pathogen-free male Sprague-Dawley rats aged 15 weeks were selected and randomly divided into blank control group, model group, and low-, middle-, and high-dose Qianlie Huazhuo Pill groups, with 10 rats in each group. Castration and subcutaneous injection of estradiol benzoate were performed to establish a rat model of CNP. The rats in the blank control group were given normal saline by gavage every day, and those in the low-, middle-, and high-dose Qianlie Huazhuo Pill groups were given the solution of Qianlie Huazhuo Pill by gavage at daily doses of 0.85 g/kg, 1.7 g/kg, and 3.4 g/kg, respectively; the course of treatment was 30 consecutive days for these groups. The rats were sacrificed after 30 days of treatment by gavage, and serum and prostate samples were collected. The histomorphological changes of the prostate were observed, the number of leukocytes in prostate tissue was compared between groups, and the serum levels of IL-2 and IL-8 and the levels of TNF-α and IL-10 in prostate tissue were measured for all groups.ResultsCompared with the model group, the treatment groups had significant improvements in inflammatory response of the prostate and the severity of prostatic lesion. Compared with the blank control group, the model group had a significant increase in the number of leukocytes in prostate tissue (P<0.05); compared with the model group, the low-, middle-, and high-dose Qianlie Huazhuo Pill groups had a significant reduction in the number of leukocytes in prostate tissue (P<0.05). Compared with the blank control group, the model group had significant increases in the serum levels of IL-2 and IL-8 (P<0.05); compared with the model group, the low-, middle-, and high-dose Qianlie Huazhuo Pill groups had significant reductions in the serum levels of IL-2 and IL-8 (P<0.05). Compared with the blank control group, the model group had significant increases in the levels of TNF-α and IL-10 in prostate tissue (P<0.05); compared with the model group, the low-, middle-, and high-dose Qianlie Huazhuo Pill groups had significant reductions in the levels of TNF-α and IL-10 in prostate tissue (P<0.05).ConclusionQianlie Huazhuo Pill has a good clinical effect in the treatment of CNP, possibly by inhibiting the expression of IL-2, IL-8, and TNF-α.

[Keywords] Chronic nonbacterial prostatitis; Qianlie Huazhuo Pill; Interleukin; Tumor necrosis factor