TGF-β/ILK信号通路在甲状旁腺激素诱导血管内皮细胞向间质细胞转化中的作用

李 宁，张克勤，彭侃夫

(1.重庆大学附属中心医院/重庆市急救医疗中心/重庆市第四人民医院内分泌肾内科 400014； 2.陆军军医大学第一附属医院肾科，重庆 400038)

尿毒症是慢性肾衰竭(chronic kidney disease，CKD)等多种肾脏疾病转归的最终形式。对尿毒症患者机体产生严重致病作用的主要是潴留堆积的各种无机或有机分子，被称为尿毒症毒素。按来源来分，主要包括本来就需排泄的有毒物质和机体正常所需由于排除障碍导致含量剧增的物质，前者的代表性分子有尿素、肌酐，而甲状旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)是后者的典型代表[1]。笔者在前期研究中发现，PTH可以诱导人血管内皮细胞发生内皮细胞-间质转化(endothelial-mesenchymal transition，EndMT)[2]，既可以观察到细胞形态发生纤维化转变，又可以检测到EndMT一系列标志分子的表达改变，包括血管内皮细胞标志分子血管内皮钙黏蛋白(VE-cadherin)和CD31的表达降低，纤维细胞标志分子α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达升高，提示尿毒症患者血清中较高水平的PTH可能通过诱导血管内皮细胞发生EndMT来产生对心血管的损伤，但是其中的分子机制尚不清楚。近年来的研究发现，整合素连接激酶(integrin-linked kinase，ILK)作为转化生长因子β(TGF-β)信号下游效应蛋白，其激活与EndMT密切相关[3-5]。因此，本研究进一步利用TGF-β及ILK的抑制剂，探讨TGF-β/ILK通路在PTH诱导EndMT中的作用。

1 材料与方法

1.1材料 人主动脉血管内皮细胞(HAECs)及内皮细胞培养基购自美国Lifeline Cell Technology公司。PTH购自美国Anaspec公司(货号：27080)，按照说明书溶解于无菌水中。TGF-β抑制剂SB431542、Pirfenidone(PFD)购自美国Selleck公司，ILK抑制剂Cpd22购自美国Millipore公司，均按照说明书溶解于二甲基亚砜(DMSO)中。蛋白质印迹法(Western blot)所用抗体包括VE-cadherin(美国Cell Signaling Technology公司，货号：2500)，CD31(美国Cell Signaling Technology公司，货号：3528)，α-SMA(美国Abcam公司，货号：ab5694)，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)(美国Proteintech公司，货号：60004-1)。

1.2方法

1.2.1细胞培养及刺激处理 取对数生长期的HAECs接种于6孔细胞培养板中(3×105个/孔)，置于CO2细胞培养箱中培养，同步静止12 h后开始加入诱导刺激因素：PTH诱导组加入PTH至终浓度1×10-8mol/L，对照组加入等体积的注射用水；抑制剂组分别加入不同浓度的抑制剂，对照组和单独加PTH的实验组(PTH实验组)同时加入DMSO(1∶1 000)作为抑制剂的溶剂对照。诱导刺激处理36 h后，收取各组细胞分别对各个标志分子的蛋白水平进行检测。

1.2.2Western blot 吸去细胞培养液，磷酸盐缓冲液(PBS)洗2次，加入1×十二烷基硫酸钠(SDS)上样缓冲液吹下细胞，转移至EP管中，冰上超声30 s，煮沸10 min，即为全细胞裂解液，于-80 ℃保存；取适量蛋白裂解液上样进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，冰浴条件下电转移至硝酸纤维素膜；5%脱脂奶粉[Tris缓冲盐水/吐温(TBS/T)配制]室温封闭2 h；加一抗工作液，4 ℃反应过夜；加辣根过氧化酶标记的二抗工作液，室温反应1 h；化学发光法显示目标条带。采用Image J软件对Western blot目标条带进行灰度扫描。

2 结 果

2.1TGF-β抑制剂作用后HAECs内皮细胞标志物的表达 为了探讨TGF-β通路在PTH诱导HAECs细胞发生EndMT中的作用，采用TGF-β的两种抑制剂SB431542和PFD抑制TGF-β通路，检测HAECs内皮细胞标志物VE-cadherin和CD31蛋白水平的改变。由图1可见，1×10-8mol/L的PTH诱导刺激后，HAECs细胞中VE-cadherin和CD31的蛋白水平均出现明显降低。随着TGF-β抑制剂 PFD和SB431542的加入，VE-cadherin和CD31的蛋白水平有明显的恢复，并且随着抑制剂浓度的增加，VE-cadherin和CD31的蛋白表达水平也随之升高。

A：Western blot蛋白条带；B：蛋白条带进行灰度扫描后以GAPDH为内参计算蛋白相对表达水平;*：P<0.05，与对照组比较；#：P<0.05，与PTH实验组比较

图1 TGF-β抑制剂作用后HAECs内皮细胞标志物的表达

A：Western blot蛋白条带；B：蛋白条带进行灰度扫描后以GAPDH为内参计算蛋白相对表达水平；*：P<0.05，与对照组比较；#：P<0.05，与PTH实验组比较

图2 TGF-β抑制剂作用后HAECs细胞纤维化标志物的表达

2.2TGF-β抑制剂作用后HAECs细胞纤维化标志物的表达 进一步检测HAECs中α-SMA蛋白水平在TGF-β抑制剂SB431542和PFD干预处理后的表达改变。由图2可见，1×10-8mol/L的PTH诱导刺激后，HAECs细胞中α-SMA的蛋白表达水平出现了明显升高。随着TGF-β通路抑制剂SB431542和PFD的加入，α-SMA的蛋白水平出现了明显的降低，并且随着抑制剂浓度的增加，α-SMA的蛋白水平出现剂量依赖性下降，几乎恢复到对照组的水平。

A：Western blot蛋白条带；B：蛋白条带进行灰度扫描后以GAPDH为内参计算蛋白相对表达水平；*：P<0.05，与对照组比较；#：P<0.05，与PTH实验组比较

图3 ILK抑制剂作用后HAECs内皮细胞标志物的表达

A：Western blot蛋白条带；B：蛋白条带进行灰度扫描后以GAPDH为内参计算蛋白相对表达水平；*：P<0.05，与对照组比较；#：P<0.05，与PTH实验组比较

图4 ILK抑制剂作用后HAECs纤维化标志物的表达

2.3ILK抑制剂作用后HAECs内皮细胞标志物的表达 为了探讨ILK在PTH诱导HAECs细胞发生EndMT中的作用，采用ILK抑制剂Cpd22处理细胞，检测HAECs内皮细胞标志物VE-cadherin和CD31蛋白水平的改变。由图3可见，1×10-8mol/L的PTH诱导HAECs细胞中VE-cadherin和CD31蛋白水平出现明显降低，随着ILK抑制剂Cpd22的加入，VE-cadherin和CD31的蛋白水平有比较明显的恢复，并且随着抑制剂浓度剂量的增加，VE-cadherin和CD31的蛋白表达水平出现剂量依赖性的增加。

2.4ILK抑制剂作用后HAECs细胞纤维化标志物的表达 进一步检测HAECs中α-SMA蛋白水平在ILK抑制剂Cpd22干预条件下的改变。由图4可见，1×10-8mol/L的PTH刺激使HAECs细胞中α-SMA的蛋白水平出现明显升高，随着ILK抑制剂Cpd22的加入，α-SMA的蛋白表达水平出现明显的降低，并且随着抑制剂浓度剂量的增加，α-SMA的蛋白水平出现更加明显的下降。

3 讨 论

文献表明，大多数早期和晚期CKD患者血清PTH水平明显升高[6-7]。而PTH是由甲状旁腺主细胞分泌的一种激素，主要调节人体钙、磷代谢，对健康人体内没有危害。但是，由于尿毒症患者正常肾功能受损，不但引起PTH降解减缓，排泄也难以正常进行。因此，PTH不断在患者体内积蓄。并且患者大多钙磷代谢紊乱(由肾衰竭引起)，患者血清钙离子水平降低、血磷水平升高，PTH在刺激下分泌增加，进一步诱发PTH的蓄集。这些变化，会导致多种并发症，主要有继发性甲状旁腺功能亢进、皮肤瘙痒、转移性钙化、肾性骨病和周围神经病变等。已有大量文献报道，PTH受体存在于成纤维细胞和心肌细胞表面。此外，PTH也可作用于心肌。早期的研究发现，PTH是导致心肌间质纤维化的重要因素，而这由患者体内过高的PTH导致心肌间质的非修复性纤维化及胶原堆积引起。

细胞发生EndMT时，细胞丢失其内皮细胞标志蛋白VE-cadherin和CD31等，获得性表达间充质细胞标志物α-SMA等[8-10]。本实验结果表明，在PTH作用下血管内皮细胞HAECs的VE-cadherin和CD31表达降低(图1、3)，而α-SMA的表达变化则相反(图2、4)，说明PTH作为尿毒症毒素，可以减弱HAECs的内皮细胞特征，同时增强纤维化的特征，诱导HAECs发生较明显的EndMT。

TGF-β是一种生长调节因子，具有多种细胞生物学功能。TGF-β的分泌方式有多种，主要有自分泌、旁分泌及内分泌3种方式；TGF-β主要调控细胞分化、增殖、凋亡以及细胞外基质，也可深入调控组织形成、分化等；TGF-β可与细胞表面受体结合，从而传导信号。研究发现，间质纤维化与TGF-β1功能密切相关，TGF-β1是诱导EndMT发生的关键因子之一[5,11-12]。有研究表明，TGF-β可诱导小鼠胚胎干细胞来源的EndMT[13]。此外，血管内皮细胞的增殖和表型转化也可由TGF-β刺激产生，主要表型是成纤维细胞分子标志α-SMA水平升高、内皮细胞标志蛋白CD31表达则明显下调[14-15]。本研究主要针对HAECs运用PTH刺激诱导，并额外使用TGF-β信号通路抑制剂SΒ431542和PFD。结果发现，PTH诱导HAECs发生的EndMT可被抑制剂SΒ431542和PFD逆转，如HAECs内皮细胞标志分子减少(图1)、纤维化分子标志增加(图2)。结果提示，PTH诱导HAECs发生EndMT可能受到TGF-β信号通路的有效调控。

学术界已发现，TGF-β调控上皮间充质转化(EMT)的发生，Smad依赖性及非Smad依赖性是两种主要的信号通路[16]。非Smad依赖性通路涉及多种激酶通路，包括细胞外调节蛋白激酶-丝裂原活化蛋白激酶(ERK-MAPK)、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38-MAPK)和Rho激酶等[16]。最近的研究表明，与表型转变相关的TGF-β信号下游蛋白主要是ILK[3]。SERRANO等[3]发现，当乳腺上皮细胞内发生EMT，往往伴随ILK表达水平明显升高，通过阻断ILK可以有效逆转转化过程。上述研究表明，ILK是TGF-β1诱导EMT发生的极为重要的下游分子。另有研究尝试对肾小管上皮细胞采用TGF-β1干预，结果发现肾小管上皮细胞原型丢失，间充质细胞标志表达则明显升高，而这一表型变化可应用小分子QLT-0267(ILK抑制剂)有效抑制[17]。已有报道指出，内皮细胞与上皮细胞具有一定的同源性[9]，笔者前期的研究结果也发现HAECs的ILK水平可由PTH刺激升高[2]，为深入研究ILK在这一过程中的作用，笔者首先运用PTH诱导刺激HAECs，再加入小分子物质Cpd22(ILK抑制剂)干预，结果发现Cpd22可逆转PTH引发的HAECs的内皮细胞分子标志物的减少和纤维化标志蛋白的增加。这一结果表明，ILK信号活化在PTH诱导HAECs发生EndMT过程中起着重要的作用。

综上所述，PTH可明显诱导出HAECs发生EndMT，而且TGF-β/ILK信号通路参与调控EndMT过程。从临床价值来看，血管内皮细胞的EndMT可显著降低血管弹性、增加血管硬化，导致心血管系统损伤，对机体造成很大的危害。未来TGFβ/ILK通路可能作为抑制血管内皮细胞发生EndMT的治疗靶点，用于预防尿毒症患者的心血管损伤。

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