乳腺浸润性导管癌中CDH1基因甲基化状态及其临床意义

杨 亮，迪力夏提·金斯汗，赵 倩，朱丽萍，吴 涛，李 丹，杜 露，王 波，王喜艳

(新疆医科大学附属肿瘤医院乳腺外科一病区，乌鲁木齐 830000)

乳腺癌的发生、发展是一个多因素及多阶段复杂的过程，乳腺癌治疗后复发、转移是困扰临床的难题。恶性肿瘤浸润及转移机制一直是肿瘤研究的热点。细胞间黏附性下降是导致肿瘤转移的因素之一。肿瘤细胞转移首先是细胞黏附性改变，黏附分子介导的肿瘤细胞彼此之间的黏附力减少，出现上皮间叶性改变，肿瘤开始浸润及转移。CDH1基因是上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)的编码基因，而E-cadherin是重要的黏附分子。CDH1基因的失活与多种肿瘤发生、发展密切相关。本研究对250例乳腺浸润性导管癌组织标本中CDH1基因启动子区域5′-CpG岛的甲基化状态进行检测，探讨CDH1基因启动子甲基化在乳腺癌发生、发展过程中的作用。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2010年1月至2011年1月本院收治的250例初诊原发乳腺浸润性导管癌患者，年龄 28～75岁，中位年龄48岁；其中绝经前患者147例，绝经后患者103例。纳入标准：(1)病理确诊为乳腺浸润性导管癌患者(患者病理切片均由3位病理学专家进行病理会诊)；(2)入院前无放、化疗及内分泌治疗史；(3)卡式功能状态评分(KPS评分)≥80分，接受手术治疗；(4)无其他系统恶性肿瘤病史；(5)乳腺癌患者手术前同意采集标本并签署知情同意书。排除标准：排除乳腺浸润性小叶癌及原位癌,术前行化疗、放疗或内分泌治疗，排除乳腺癌转移肿瘤及其他特殊类型乳腺肿瘤(家族性乳腺癌、肉瘤、微乳头状癌、淋巴瘤、妊娠期乳腺癌、炎性乳腺癌等)。本研究经过本院伦理委员会批准。

1.2方法

1.2.1标本采集 取患者乳腺癌组织、相应癌旁组织、淋巴结组织及正常乳腺组织。取基因组DNA，提取的DNA经紫外分光光度计定量后，-20 ℃保存备用。

1.2.2免疫组织化学法检测E-cadherin 乳腺癌组织标本脱蜡、水化，按试剂说明书步骤采用免疫组织化学SP法染色，抗原修复采用微波法。E-cadherin染色结果的判断标准：由3位病理专科医师分别判定免疫组织化学染色结果；免疫组织化学染色的切片中随机选取5个高倍视野(×400倍),计算镜下阳性细胞百分比及着色程度。E-cadherin表达以半定量法判定：中等以上染色阳性细胞数0～<11%记为0 分，11%～<26%记为1分，26%～<51%记为2分，51%～75%记为3分，>75%记为4分；评分≤2分为低表达或阴性组，评分≥3分为高表达或阳性组。

1.2.3基因组DNA的亚硫酸氢钠修饰方法 使用亚硫酸氢钠法进行DNA修饰并纯化保存，按使用说明书操作(EpiTect Bisulfite，美国Qiagen公司)。取10 μg DNA加入3 mol/L NaOH裂解液5 μL，37 ℃变性，放置20 min，加入2 mol/L亚硫酸氢钠(pH 5.0)520 μL和0.2 mol/L氢醌30 μL，50 ℃水浴18 h。在1 mL DNA纯化树脂中加入处理的DNA样品及8%异丙醇2 mL滤析，100%乙醇与3 mol/L醋酸钠沉淀，离心，弃去上清液，干燥，加2 μL TE溶解液，-20 ℃保存备用。

1.2.4甲基特异性PCR分析 CDH1基因甲基化引物(CDH1-M)，MR：5′-TAA CTA AAA ATT CAC CTA CCG AC-3′，MF：5′-TTA GGT TAG AGG GTT ATC GCG T-3′，扩增片段长度112 bp。CDH1基因非甲基化引物(CDH1-U)，UF：5′-TAA TTT TAG GTT AGA GGG TTA TTG T-3′,UR：5′-CAC AAC CAA TCA ACA ACA CA-3′，扩增片段长度120 bp。PCR产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶成像系统观察试验结果：电泳中出现甲基化条带且没有非甲基化条带判定为CDH1基因甲基化(M)；条带中出现非甲基化条带且没有甲基化条带判定为CDH1基因非甲基化(U)；同时出现甲基化和非甲基化条带判定为半甲基化(UM)。在体外经过甲基转移酶处理过的乳腺组织基因组DNA(美国NEB公司)作为阳性对照，未处理的健康人乳腺组织DNA作为阴性对照，使用蒸馏水作为空白对照。

2 结 果

2.1CDH1基因启动子甲基化在散发性乳腺癌的发生率 250例患者乳腺癌组织标本共发现113例CDH1基因启动子甲基化，甲基化率为45.20%；癌旁组织标本中有55例CDH1基因启动子甲基化，甲基化率为22.0%；CDH1基因启动子甲基化率在乳腺癌组织与癌旁组织中比较，差异有统计学意义(χ2=30.156，P<0.01)。见图1、2。

M：Marker；A、B：CDH1基因启动子甲基特异性PCR分析；1、2、4～9：CDH1基因启动子甲基化条带；3：CDH1基因启动子未甲基化条带；NC：阴性对照；PC：阳性对照

图1 CDH1基因启动子甲基化与非甲基化电泳图

图2 乳腺癌组织与癌旁组织CDH1基因启动子甲基化情况比较

2.2E-cadherin蛋白在CDH1基因启动子甲基化与非甲基化乳腺癌组织的表达 113例患者乳腺癌组织CDH1基因甲基化标本中E-cadhenrin高表达22例(19.47%)，低表达91例(80.53%)；137例患者乳腺癌组织CDH1基因非甲基化标本E-cadhenrin高表达65例(47.44%)，低表达72例(52.55%)；E-cadhenrin表达情况在乳腺癌组织CDH1基因甲基化与未甲基化标本中比较，差异有统计学意义(χ2=21.360，P<0.01)。见图3、表1。

表1 乳腺癌组织CDH1基因启动子甲基化与E-cadherin蛋白表达的关系

2.3E-cadherin在乳腺癌组织和癌旁组织中的表达 在正常乳腺组织中E-cadherin主要分布在乳腺导管上皮和乳腺腺泡上皮。免疫组织化学法染色E-cadherin阳性为细胞膜呈棕黄色颗粒着色，E-cadherin在乳腺癌组织中多呈低表达(图4A),而在癌旁组织中多为高表达(图4B)。E-cadherin在浸润性乳腺导管癌细胞细胞膜表达减弱(图5B)，甚至缺失(图5A)。在250例患者乳腺癌组织中E-cadherin高表达的比率为34.80%(87/250)，低表达的比率为 65.20%(163/250)，乳腺癌组织E-cadherin高表达与低表达在乳腺癌和癌旁组织存在差异，差异有统计学意义(χ2=19.435，P<0.01)。

图3 CDH1基因启动子甲基化与未甲基化乳腺癌组织中E-cadherin蛋白表达情况比较

A：E-cadherin在乳腺癌组织中低表达；B：E-cadherin在癌旁组织中高表达

图4 E-cadherin在乳腺癌组织及癌旁组织中的表达(SP，×100)

A：E-cadherin不表达(-)；B：E-cadherin低表达(+)；C：E-cadherin高表达(++)；D：E-cadherin高表达(+++)

图5乳腺浸润性导管癌组织中免疫组织化学染色E-cadherin在病灶中表达(SP，×200)

2.4CDH1基因mRNA的表达情况 通过反转录定量PCR法检测CDH1基因mRNA在原发性乳腺癌、淋巴结转移乳腺癌和正常乳腺组织标本中的表达情况，见图6。CDH1基因mRNA在乳腺癌组织CDH1基因启动子甲基化标本中表达水平低(0.538±0.108)，在乳腺癌组织CDH1基因启动子非甲基化标本中表达水平较高(0.734±0.072)，二者差异有统计学意义(t=16.99，P<0.01 )，见图7A。CDH1基因mRNA的表达水平在乳腺癌淋巴结转移组、淋巴结未转移组及正常乳腺组织比较，差异有统计学意义(F=43.515，P<0.01)，见图7B。

2.5乳腺浸润性导管癌组织CDH1基因启动子甲基化与患者病理临床特征的关系 CDH1基因启动子甲基化组和未甲基化组在淋巴结是否转移、人表皮生长因子受体2(CerbB-2)表达、分子分型及肿瘤细胞组织学分级中差异有统计学意义(P<0.05)，而在民族、年龄、是否绝经、ER表达、肿块直径及Ki-67表达等因素中差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

E：CDH1基因mRNA(423 bp)；G：内部控制基因GAPDH(140 bp)；B：乳腺癌组织；NS：正常乳腺组织

图6乳腺癌和正常乳腺组织中CDH1基因mRNA的表达

A：CDH1基因启动子甲基化与未甲基化乳腺癌组织比较；B：乳腺癌淋巴结转移、淋巴结未转移及正常乳腺组织比较

图7 不同组织CDH1基因mRNA表达水平比较

续表2 CDH1启动子甲基化与乳腺癌患者临床病理的关系

淋巴结转移：腋下淋巴结、前哨淋巴结镜下宏转移，同时包括淋巴结微转移，直径<2.0 mm 的肿瘤转移病灶、成簇肿瘤细胞及单个肿瘤细胞

2.5CDH1启动子甲基化组和非甲基化组乳腺癌COX回归生存分析 乳腺浸润性导管癌CDH1启动子甲基化和非甲基化组随访60个月， CDH1启动子甲基化(n=113)和非甲基化(n=137)组COX回归分析乳腺癌5年生存率存在差异，差异有统计学意义(P<0.01)，见图8。COX多因素回归分析提示:淋巴结阳性、组织学分级高、CerbB-2阳性、三阴性分子分型、 CDH1基因启动子甲基化患者乳腺癌死亡危险性高，见表3、4。

图8 CDH1基因启动子甲基化和非甲基化生存分析

变量变量分类及赋值分组非甲基化=0,甲基化=1淋巴结情况无=0,1～3个=1,≥4个=2组织学分级Ⅰ级=1,Ⅱ级=2,Ⅲ级=3腋窝淋巴结转移N0=0,N1=1,N2=2,N3=3CerbB-2阴性=0,阳性=1分子分型Luminal A=1,Luminal B=2,HER-2(+)=3,三阴性=4

表4 CDH1基因启动子甲基化和非甲基化患者生存曲线COX多因素回归分析

3 讨 论

乳腺癌的发病率逐渐增高，已成为女性最常见的恶性肿瘤[1-2]。乳腺癌复发及转移是导致死亡的主要原因[3],恶性肿瘤浸润及转移机制中首先是细胞黏附性改变，肿瘤细胞彼此之间的黏附力减少，肿瘤出现倾向浸润及转移。因此,细胞间黏附性改变是导致肿瘤转移的重要因素之一。E-cadherin是钙黏附家族中重要的一员,目前研究发现E-cadherin参与不同肿瘤的早期发生、浸润及转移[4-6]。其表达与多种肿瘤的浸润转移、临床预后有密切联系[7]。CDH1是E-cadherin蛋白编码基因,是一种抑癌基因,抑癌基因甲基化是肿瘤发生、发展过程中基因表达沉默的主要机制，且在某些情况下是抑癌基因失活的惟一机制。在多种肿瘤组织中均有CDH1基因表达的下调,CDH1基因的表达下调除了受基因多态性、外显子突变等因素影响外．其启动子区域的5′-CpG岛异常甲基化作用近年来被越来越多的研究者所关注[8-9]。

本研究对新疆地区250例患者乳腺癌组织标本CDH1基因甲基化进行了检测,研究发现乳腺癌组织中CDH1基因甲基化和E-cadherin蛋白低表达相关(χ2=21.360，P<0.01),可能是引起E-cadherin蛋白低表达的主要因素。同时研究发现CDH1基因甲基化和淋巴结转移相关，有局部淋巴结转移的乳腺癌组织的甲基化表达率明显高于无局部淋巴结转移乳腺癌组织，二者之间差异有统计学意义(χ2=19.086，P<0.01)。推测CDH1基因甲基化抑制了E-cadherin蛋白表达,使E-cadherin不能发挥正常作用维持细胞形态及连接，导致细胞自肿瘤组织中脱落进而引起肿瘤的转移，这说明 CDH1基因改变和乳腺癌转移密切相关。当然，基因表达下调除甲基化外，还有其他的一些CDH1基因改变，如基因突变也是引起基因表达下调的原因之一。章海波等[10]在肺癌中研究发现，CDH1基因rs16260C>A遗传变异可显著增加非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLS)患者确诊时为晚期并发生转移的概率,CDH1基因rs16260C>A遗传变异可促进NSCLS的进展[10]。因此，CDH1基因的甲基化也不能完全反映出E-cadherin的表达缺失程度。也有可能一部分肿瘤细胞的CDH1基因没有甲基化而失活，这也可以解释肿瘤组织中E-cadherin 蛋白表达的异质性。本研究提示:CDH1基因启动子甲基化和非甲基化乳腺癌患者5年生存率比较，差异有统计学意义(P<0.01) ，和部分研究基本一致[9]。当然乳腺癌预后和多种因素相关，CDH1启动子甲基化改变是否与乳腺癌的不良预后有关仍需要大量的研究。本研究由于样本量偏小，研究数据尚不能确切说明影响肿瘤预后，还需要进一步大样本的研究。

CDH1基因甲基化的表观遗传学改变已经成为肿瘤研究中重要的分子之一[11-12]，目前，DNA 甲基化导致转录失活这一机制已基本明确，但乳腺癌中CDH1基因甲基化改变的原因及其调控机制尚不清楚。因此，需进一步积累更多的临床资料、扩大样本量进行深入研究。CDH1基因信号传导通路及调控机制仍需要继续深入研究。

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