SMC4对人乳腺癌细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响及其机制研究

郑世杨，黄泽楠，李 玺

(中山大学附属第三医院甲乳外科，广州 510000)

乳腺癌是常见的恶性肿瘤之一，根据全球癌症报告，2016年全球约249 260人诊断为乳腺癌，约占女性恶性肿瘤新发病例的29%[1]。探究乳腺癌发生、发展的潜在机制，寻找新的治疗靶点仍是目前的研究热点。染色体结构维持蛋白4(structural maintenance of chromosome 4，SMC4)是SMC的核心成员之一，在有丝分裂过程染色体的凝集和分离中发挥着重要作用[2-3]。此外，有研究指出SMC4可能参与各种非有丝分裂的染色体功能，如维持基因的沉默状态、DNA修复等[4]。近年来研究发现，SMC4在肝癌、结直肠癌、前列腺癌及胶质瘤等恶性肿瘤中均呈高表达，并与肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭密切相关[5-10]。目前，关于SMC4与乳腺癌的关系国内外鲜有报道。本研究着重检测SMC4在乳腺癌组织及其对应癌旁组织中的表达，并通过小分子干扰RNA(siRNA)特异性低SMC4表达来研究其对乳腺癌细胞系MDA-MB-231的影响及潜在的机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞株与组织标本 人乳腺上皮细胞系(MCF10A)由本院疫苗研究所提供，人乳腺癌细胞株(MDA-MB-231、T47D、SK-BR-3、MCF7、MDA-MB-468)由中山大学肿瘤防治中心惠赠。20份组织标本取自2016年11月至2017年3月在本院手术切除的乳腺癌患者，癌旁组织距离癌组织超过3 cm，所有患者均由病理科确诊为浸润性乳腺癌，临床资料完整。在取得组织标本前患者均未接受过放化疗等其他抗肿瘤治疗。

1.1.2主要试剂 胎牛血清(FBS)、DMEM高糖培养基、DMEM/F12培养基及蛋白胰酶均购自美国Gibco公司，Trizol试剂购自美国Invitrogen公司，CCK-8试剂购自日本东仁化学科技公司，反转录试剂盒及荧光定量PCR试剂盒购自德国Roche公司，兔抗人SMC4抗体购自美国Abcam公司，兔抗人磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)、磷酸化PI3K(p-PI3K)、蛋白激酶B(AKT)、磷酸化AKT(p-AKT)抗体均购自美国CST公司。引物由Thermo Fisher Scientific公司合成。SMC4特异性siRNA由广州市锐博生物科技有限公司设计合成，其对应的靶序列是：5′-CCA CAA GAG TAG CAT ATC A-3′，转染试剂购自广州市锐博生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 人乳腺癌细胞(MDA-MB-231、T47D、SK-BR-3、MCF7、MDA-MB-468)于含有FBS(10%)、青霉素(100 U/mL)及链霉素(100 μg/mL)的DMEM高糖培养基中，人乳腺上皮细胞系(MCF10A)于含有马血清(5%)、胰岛素(10 μg/mL)、表皮生长因子(20 ng/mL)、霍乱毒素(100 ng/mL)、氢化可的松(0.5 μg/mL)的DMEM/F12(1∶1)培养基中，37 ℃，5% CO2细胞培养箱常规培养。

1.2.2瞬时转染 将MDA-MB-231细胞接种到6孔板上，当细胞密度到达50%～60%时即可进行转染。设si-SMC4组及siRNAsi-NC组，每孔按照10 μL 1×riboFECTTMCP Buffer，5 μL 20 μmol/L siRNA储存液及10 μL riboFECTTMCP Reagent配置转染复合物，并在室温孵育10～15 min。然后将每孔24 μL加入6孔板中，置于37 ℃、体积分数5% CO2恒温培养箱中培养，6 h后更换培养液，48、72 h后分别提取RNA及蛋白进行后续实验。并设未转染细胞为对照组。

1.2.3RNA提取及反转录 将20份乳腺癌组织及其癌旁组织标本在液氮中研磨成粉末，用Trizol试剂提取组织粉末、细胞总RNA，检测RNA浓度后，按照Roche反转录说明书将RNA反转录成cDNA。

1.2.4定量PCR(qPCR)检测SMC4 mRNA在组织及细胞中的表达 以反转录获得的cDNA为模板进行PCR扩增，检测SMC4 mRNA在乳腺癌组织、对应的癌旁组织及各细胞系中的表达情况，以3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为内参，反应条件为：95 ℃预变性5 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，共40个循环，溶解曲线95 ℃ 5 s，65 ℃ 1 min，72 ℃ 20 s，97 ℃每秒0.11 ℃逐步降温，42 ℃冷却。以2-ΔΔCt值表示SMC4 mRNA的相对表达水平。SMC4的上游引物序列为：5′-GAC TGA ACA CGA TGA GGG TAT G-3′；下游引物序列为：5′-CAA CTC TCC GAC ACA AGA CTT TA-3′。

1.2.5蛋白质印迹法(Western blot)检测细胞内SMC4蛋白的表达 用蛋白裂解液提取细胞总蛋白，根据二喹啉甲酸(BCA)法检测到的蛋白浓度调整上样量，配置浓度为10%的分离胶，每条泳道上样量为50 μg，依次进行蛋白电泳、转膜、封闭，加入SMC4一抗(1∶300)、PI3K(1∶1 000)、p-PI3K(1∶1 000)、AKT(1∶1 000)、p-AKT(1∶1 000)及GAPDH一抗(1∶1 000)，4 ℃ 孵育过夜。二抗室温孵育2 h，暗室内电化学发光(ECL)显色拍照。

1.2.6细胞增殖活性检测 设si-SMC4组、si-NC组及对照组，每组5个复孔。取转染24 h后细胞，消化重悬使细胞终浓度为1×104cells/mL，按1 000个/孔接种于96孔板中，置于37 ℃、体积分数5% CO2恒温培养箱培养，分别于0、1、2、3、4、5、6、7 d内取出96孔板，每孔加10 μL CCK8，再放回培养箱中孵育3 h，用酶标仪检测各孔450 nm处吸光度值(A450值)。

1.2.7平板克隆实验 取转染24 h后细胞，消化重悬，按1 000个/孔接种于6孔板中，转动吹打使细胞均匀分布，并置于细胞培养箱中培养10～14 d，肉眼可见细胞集群后取出，磷酸盐缓冲液(PBS)小心浸洗1次，用冰甲醇固定15 min，再用PBS浸洗1次，用0.1%结晶紫染色30 min，流水缓慢洗去染色液，空气干燥后，在显微镜下计算克隆数，最终计算克隆形成率。克隆形成率=(克隆数/接种细胞数)×100%。

1.2.8细胞迁移及侵袭实验 将600 μL含有10% FBS的DMEM培养基加入24孔板中，再将Transwell小室放入24孔板中，若为侵袭实验，则首先需在上室加入用无血清DMEM培养基稀释的Matrigel(每孔40 μL，体积稀释比例为1︰6)，置于细胞培养箱中3～4 h，待凝固后再将小室转入已经加入10% FBS的DMEM培养基的24孔板中。取转染24 h后细胞消化，用300 μL无血清DMEM培养基重悬5×104个细胞，并接种于Transwell上室，细胞培养12 h后去除小室，PBS小心浸洗1次，用冰甲醇固定15 min，再用PBS浸洗1次，用0.1%结晶紫染色30 min，静水缓慢洗去染色液，再用棉签轻轻擦去上室未穿过小室膜的细胞，取放大倍数为100倍，镜下观察5个视野，计数平均细胞数。

2 结 果

2.1SMC4 mRNA在乳腺癌组织及细胞水平的表达 应用qPCR法检测SMC4 mRNA在20例患者乳腺癌组织及对应的癌旁组织中的表达，结果发现SMC4 mRNA在70%的乳腺癌组织中高表达，其表达水平明显高于癌旁组织(t=3.265，P<0.05)，见图1。用同样的方法检测人乳腺上皮细胞(MCF10A)及人乳腺癌细胞(MDA-MB-231、T47D、SK-BR-3、MCF7、MDA-MB-468)中SMC4 mRNA的表达情况，结果显示乳腺癌细胞中的SMC4 mRNA的表达均明显高于MCF10A，其中MDA-MB-231细胞SMC4 mRNA表达水平最高，与MCF10A比较差异有统计学意义(t=5.09，P<0.05)，见图2A。

图1 SMC4 mRNA在乳腺癌组织及其对应的癌旁组织的表达情况

2.2SMC4蛋白在细胞水平的表达 应用Western blot检测人乳腺上皮细胞(MCF10A)及人乳腺癌细胞(MDA-MB-231、T47D、SK-BR-3、MCF7、MDA-MB-468)中SMC4蛋白表达情况，与qPCR结果一致，乳腺癌细胞中SMC4蛋白表达水平明显高于MCF10A，其中MDA-MB-231细胞SMC4蛋白水平最高，与MCF10A比较差异有统计学意义(t=4.06，P<0.05)，见图2B。

A：SMC4 mRNA；B：SMC4蛋白；*：P<0.05，与MCF10A比较

图2 SMC4 mRNA及蛋白在MCF10A及各乳腺癌细胞系中的表达

2.3干扰MDA-MB-231中SMC4表达效果检测 用特异性siRNA转染MDA-MB-231细胞后，与si-NC组相比，si-SMC4组中SMC4 mRNA及蛋白水平明显降低，差异有统计学意义(t=3.03、4.19，P<0.05)。si-NC组及对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图3A、B。

A：SMC4 mRNA；B：SMC4蛋白；*：P<0.05，与si-NC组比较

图3 siRNA干扰后MDA-MB-231中SMC4 mRNA及

蛋白表达情况

2.4SMC4对MDA-MB-231增殖及克隆能力的影响 CCK8增殖实验，结果显示，在干扰后第3天，si-SMC4组(0.540±0.016)较si-NC组(0.960±0.040)增殖率明显下降，差异有统计学意义(t=3.48，P<0.05)；对照组与si-NC组无明显差异(P>0.05)，见图4。干扰SMC4表达可明显抑制MDA-MB-231细胞的克隆能力，相较于si-NC组[(46.0±2.0)%]，si-SMC4组[(18.0±1.9)%]克隆形成率明显降低(t=19.01，P<0.05)，见图5。

图4 敲低SMC4表达对细胞增殖的影响

2.5SMC4对MDA-MB-231迁移及侵袭能力的影响 在Transwell迁移实验中，si-SMC4组的穿膜细胞数明显低于si-NC组，差异有统计学意义(t=10.18，P<0.05)，见图6；在侵袭试验中，相较于si-NC组，si-SMC4组的穿模细胞数明显减少，差异均有统计学意义(t=9.89，P<0.05)，上述两种实验中si-NC组及对照组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见图7。

A:平板克隆实验中细胞克隆的代表图；B：细胞克隆形成率；*:P<0.05,与si-NC组比较

图5敲低SMC4表达对细胞克隆形成的影响

2.6干扰SMC4表达后对PI3K/AKT通路的影响 特异性干扰SMC4的mRNA及蛋白表达后，si-SMC4组中PI3K/AKT通路的磷酸化蛋白水平均明显下降(p-AKT：t=6.01，P<0.05；p-PI3K：t=7.01，P<0.05)，而未磷酸化的AKT及PI3K在3组细胞间的表达均无明显差异(P>0.05)，见图8。

A:Transwell实验中细胞迁移的代表图(龙胆紫染色，×100);B:穿膜细胞数；*:P<0.05,与si-NC组比较

图6敲低SMC4表达对细胞迁移的影响

A:侵袭实验中细胞侵袭的代表图(龙胆紫染色，×100);B:穿膜细胞数；*:P<0.05,与si-NC组比较

图7敲低SMC4表达对细胞侵袭的影响

A：AKT蛋白；B：p-AKT蛋白；C：PI3K与p-PI3K蛋白

图8敲低SMC4表达对PI3K/AKT通路的影响

3 讨 论

本研究首次检测SMC4在乳腺癌组织及细胞中的表达，发现SMC4 mRNA在乳腺癌组织中异常高表达，在乳腺癌细胞系中，SMC4 mRNA及蛋白表达均高于MFC10A。此外，本研究进一步分析siRNA干扰SMC4表达后对乳腺癌细胞的影响，发现敲低SMC4后可以抑制MDA-MB-231的增殖、迁移及侵袭，并且可能是通过抑制PI3K/AKT导致。

SMC4是染色体腺苷三磷酸(ATP)酶中SMC家族的重要组成部分之一，研究表明SMC4在真核细胞染色体的凝集和分离中有重要作用[2]，在细胞周期从G1期进展到S期时，SMC4还是维系S期正常进展的重要蛋白之一[3]。有研究指出，SMC4在肝癌组织中异常高表达，并且与肿瘤低分化、血管侵犯明显相关[6-7]。在结直肠癌中，过表达SMC4可以促进肿瘤细胞增殖、迁移及侵袭[5，8]。在前列腺癌中，高表达SMC4的患者有更高的肿瘤转移率及较差的预后[9]。JIANG等[10]的研究显示，上调SMC4的表达可能通过转化生长因子β(TGF-β)/Smad信号通路促进胶质瘤细胞的侵袭性。因此，SMC4可能在肿瘤发生、发展中起重要作用。本研究通过应用qPCR检测20例患者乳腺癌组织及对应癌旁组织、乳腺上皮细胞系(MCF10A)、乳腺癌细胞系(MDA-MB-231、T47D、SK-BR-3、MCF7、MDA-MB-468)中SMC4的表达情况。结果发现，组织水平中，SMC4在癌组织中的表达明显高于癌旁组织(P<0.05)；在乳腺癌细胞系中SMC4的表达高于MCF10A，其中MDA-MB-231表达差异最为显著。与此同时，本研究应用Western blot检测SMC4蛋白在细胞系中的表达情况，与qPCR结果一致，SMC4蛋白在乳腺癌细胞系中表达较高，其中MDA-MB-231差异最为明显。为探究SMC4表达对乳腺癌细胞功能的影响，本研究选用MDA-MB-231细胞进行细胞功能实验。通过应用siRNA干扰SMC4的表达后，观察到处理组细胞的增殖速度、侵袭及迁移能力均较对照组明显降低。

在探究SMC4影响肿瘤细胞侵袭性的潜在机制时，笔者预测可能与PI3K/AKT信号通路相关。目前许多研究表明，PI3K/AKT信号通路在肿瘤细胞的迁移、增殖、侵袭等方面有重要的作用。激活的PI3K使质膜上产生3-磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)，PIP3与AKT结合使其从细胞质转移到细胞膜上获得催化活性，由磷脂酰肌醇依赖性蛋白激酶(PDK)、激活AKT(磷酸化)，p-AKT从细胞膜脱落后进入细胞质或细胞核，调控下游蛋白从而调控细胞生长、运动和凋亡等[11-12]。在肝癌、胃癌和结直肠癌等许多肿瘤中均有p-AKT的过度表达[13-15]。在本研究中，用特异性SMC4 siRNA转染MDA-MB-231细胞后，处理组的p-PI3K及p-AKT蛋白表达水平较对照组均明显减少。因此笔者推测，下调SMC4表达后抑制乳腺癌细胞增殖、迁移及侵袭可能与抑制了PI3K/AKT信号通路的激活相关。

综上所述，SMC4在乳腺癌组织及细胞中均呈高表达，干扰SMC4 mRNA的表达可抑制MDA-MB-231细胞的增殖、迁移及侵袭能力，其机制可能与PI3K/AKT信号通路的激活相关。基于本次研究的结果，随着以后相关实验的开展和研究，SMC4有望成为新的治疗靶点。

[1]SIEGEL R L，MILLER K D，JEMAL A．Cancer statistics,2016[J].CA Cancer J Clin，2016，66(1)：7-30．

[2]FREEMAN L，ARAGON-ALCAIDE L，STRUNNIKOV A．Strunnikov,The condensin complex governs chromosome condensation and mitotic transmission of rDNA[J]．J Cell Biol，2000，149(4)：811-824．

[4]HIRANO T．Condensins:universal organizers of chromosomes with diverse functions[J]．Genes Dev，2012，26(15)：1659-1678．

[5]FENG X D，SONG Q，LI C W，et al．Structural maintenance of chromosomes 4 is a predictor of survival and a novel therapeutic target in colorectal cancer[J].Asian Pac J Cancer Prev，2014，15(21)：9459-9465．

[6]ZHOU B，YUAN T，LIU M，et al．Overexpression of the structural maintenance of chromosome 4 protein is associated with tumor de-differentiation,advanced stage and vascular invasion of primary liver cancer[J]．Oncol Rep，2012，28(4)：1263-1268．

[7]ZHOU B，CHEN H，WEI D，et al．A novel miR-219-SMC4-JAK2/Stat3 regulatory pathway in human hepatocellular carcinoma[J].J Exp Clin Cancer Res，2014，33：55．

[8]JINUSHI T，SHIBAYAMA Y，KINOSHITA I，et al．Low expression levels of microRNA-124-5p correlated with poor prognosis in colorectal cancer via targeting of SMC4[J]．Cancer Med，2014，3(6)：1544-1552．

[9]ZHAO S G，EVANS J R，KOTHARI V，et al．The landscape of prognostic outlier genes in high-risk prostate cancer[J]．Clin Cancer Res，2016，22(7)：1777-1786．

[10]JIANG L，ZHOU J，ZHONG D，et al．Overexpression of SMC4 activates TGFbeta/Smad signaling and promotes aggressive phenotype in glioma cells[J]．Oncogenesis，2017，6(3)：e301．

[11]XUE G，RESTUCCIA D F，LAN Q，et al．Akt/PKB-mediated phosphorylation of Twist1 promotes tumor metastasis via mediating cross-talk between PI3K/Akt and TGF-beta signaling axes[J]．Cancer Discov，2012，2(3)：248-259．

[12]HILDEBRANDT M A，LIPPMAN S M，ETZEL C J，et al．Genetic variants in the PI3K/PTEN/AKT/mTOR pathway predict head and neck cancer patient second primary tumor/recurrence risk and response to retinoid chemoprevention[J]．Clin Cancer Res，2012，18(13)：3705-3713．

[13]CAO F，ZHANG C，HAN W，et al．p-Akt as a potential poor prognostic factor for gastric cancer:a systematic review and meta-analysis[J]．Oncotarget，2017，8(35)：59878-59888．

[14]CHEN J S，WANG Q，FU X H，et al．Involvement of PI3K/PTEN/AKT/mTOR pathway in invasion and metastasis in hepatocellular carcinoma:association with MMP-9[J]．Hepatol Res，2009，39(2)：177-186．

[15]KHOR T O，GUL Y A，ITHNIN H，et al．Positive correlation between overexpression of phospho-BAD with phosphorylated Akt at serine 473 but not threonine 308 in colorectal carcinoma[J]．Cancer Lett，2004，210(2)：139-150．