急性白血病β-catenin与LEF1基因表达的相关性

王巍 刘文鑫 黄永彬 洪运广 杨志刚

1广东医科大学附属医院血液病研究室（广东湛江 524000）；2上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院血液科实验室（上海 200437）

Wnt/β-catenin信号通路是一条在进化中较为保守的通路，该通路活化后通过关键分子β-catenin与核内转录因子TCF/LEF（T cell factor/Lymphoid enhancer factor）结合形成转录复合体、调控下游靶基因表达而发挥生物学作用，其异常激活与多种肿瘤包括急性白血病（acute leukemia，AL）发病相关［1-5］。脊椎动物基因组一般都含有4种TCF/LEF，即LEF1、TCF1、TCF3和TCF4，其中LEF1与白血病发生发展的关系较为密切［6-9］。为研究Wnt/β-catenin信号通路是否通过β-catenin/LEF1转录复合体在AL发病中发挥作用，本文检测了AL患者β-catenin和LEF1的表达并分析了相关性，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 病例资料及细胞株 收集广东医科大学附属医院血液科2016年3月至2017年3月初诊AL患者骨髓标本85例，其中男56例、女29例，中位年龄39岁（10～79岁）。急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）62例，其中 M1 2例、M2 10例、M3 13例、M4 5例、M5 28例、M6 1例、AML未定型3例；急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）23例，其中 B-ALL 20例，T-ALL 3例，诊断符合张之南主编的《血液病诊断及疗效标准》（第3版）。对照组20例为同期诊治的非恶性血液病患者及造血干细胞移植供着（增生性贫血9例，原发免疫性血小板减少症5例，感染性骨髓像3例，移植供着3例），其中男9例，女11例，中位年龄37.5岁（14～65岁）。人白血病细胞株K562、HL-60、Raji为广东医科大学附属医院血液病研究室保存，THP-1细胞由广东医科大学附属医院消化内科全娟花博士馈赠。

1.2 主要试剂 淋巴细胞分离液购置天津灏洋生物公司；TRIzol、逆转录试剂盒、SYBR@Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒购自TaKaRa公司。

1.3 骨髓单个核细胞分离及实时定量RT-PCR取抗凝骨髓液2～5 mL，淋巴细胞分离液分离单个核细胞，1×107细胞加1 mL TRIzol吹打混匀，提取总RNA，紫外分光光度计检测RNA质量和浓度，按照TaKaRa逆转录试剂盒说明书逆转录cDNA。PCR引物用在线软件primer 3设计好后由英潍捷基公司合成，β-catenin及内参基因GAPDH引物序列同前［11］，LEF1上游引物：5′-AGGCCTCTACAACAAGGGAC-3′，下游引物：5′-TCCTGGAGAAAAGTGCTCGT-3′，扩增片段长度208 bp。按TaKaRa公司SYBR@Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒说明书进行PCR 反应，总体系 10 μL，其中 SYBR@Premix Ex TaqⅡ（2×）5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，cDNA 1 μL，灭菌超纯水3.2 μL。PCR扩增条件：95℃预变性30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，共45个循环；之后进行熔解曲线分析。计算2-ΔCT值作为各标本mRNA相对表达量，ΔCT=目的基因CT值-内参基因CT值。

1.4 细胞培养 K562、HL-60、THP-1、Raji细胞于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养，待细胞呈对数生长时，取1×107细胞加1 mL TRIzol提取RNA并逆转录，定量PCR检测β-catenin及LEF1表达。

1.5 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。细胞株检测结果用均数±标准差表示；病例标本检测结果不符合正态分布，用中位数表示，组间比较用Mann-WhitneyU检验，相关性分析用Spearman相关。P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RNA质量及方法可靠性分析 所提RNA经分光光度计检测，A260nm/A280nm值均在1.8～2.0之间，纯度好，可用于定量PCR检测。熔解曲线分析显示，各基因PCR扩增产物熔解温度均一，熔解峰为锐利的单一峰，说明扩增产物均一，无非特异扩增及引物二聚体（图1）。

图1 β-catenin、LEF1及GAPDH PCR反应熔解曲线Fig.1 Resolving curves of β-catenin，LEF1 and GAPDH PCR products

2.2 AL患者β-catenin、LEF1 mRNA表达及相关性 β-catenin和LEF1在AML、ALL及对照组均可检测到表达，β-catenin mRNA表达由高到低依次为ALL、AML和对照组，其中ALL与对照组、AML与对照组相比，差异具有统计学意义（Z=-3.008，P=0.003；Z=-2.333，P=0.020），ALL与AML之间差异无统计学意义（Z=-1.746，P=0.081）。LEF1 mRNA表达由高到低的依次为ALL、对照组和AML，ALL与对照组、AML与对照组、ALL与AML差异均有统计学意义（Z=-5.430，P=0.000；Z=-3.191，P=0.001；Z=-6.781，P=0.000）（表1）。Spearman相关分析显示，ALL、AML组β-catenin与LEF1 mRNA表达均呈正相关（r=0.526，P=0.010；r=0.420，P=0.001）。

2.3 AL细胞株β-catenin、LEF1 mRNA表达 三种AML细胞株，THP-1细胞β-catenin mRNA表达最高，LEF1表达最低；K562细胞β-catenin mRNA表达最低，LEF1表达最高；HL60细胞β-catenin、LEF1 mRNA表达介于前两种细胞株之间。THP-1细胞β-catenin、LEF1 mRNA表达方向基本与AML患者一致，可作为研究Wnt/β-catenin信号通路的AML细胞模型。Raji细胞与AML细胞株相比βcatenin mRNA表达最低，LEF1表达也最低，基本检测不到。Raji细胞株β-catenin、LEF1 mRNA表达方向与ALL患者不同，不宜作为研究Wnt/βcatenin信号通路的ALL细胞模型（表1）。

3 讨论

Wnt通路是一条在进化中较为保守的信号通路，分为经典的Wnt/β-catenin通路、非经典的Wnt/Ca2+和Wnt/PAP（planar cell polarity，平面细胞极性）通路，其中Wnt/β-catenin信号通路研究较多。Wnt/β-catenin通路简单地说由胞外因子（Wnt蛋白）、跨膜受体（frizzled蛋白和LRP5/6）、胞内蛋白复合体（APC、Axin、GSK-3β、CK1、β-catenin等）、核内转录因子（TCF/LEF）、下游靶基因等组成，其中β-catenin是关键分子、TCF/LEF是转录调控开关。Wnt/β-catenin信号通路活化后β-catenin降解减少，胞浆中增多的β-catenin进入细胞核，与核内转录因子TCF/LEF结合形成转录复合体、调控下游靶基因转录而发挥该通路的调控作用。

表1 β-catenin和LEF1 mRNA在AL、对照组和细胞株中的表达Tab.1 Expressions of β-catenin and LEF1 mRNA in AL groups，control group and cell lines

TCF/LEF家族中LEF1参与淋巴细胞分化［10-11］、粒系发育［12］，与白血病发生发展关系较密切，比如过表达LEF1基因的小鼠可发展成为B-ALL或免疫球蛋白重链D-J重排的AML［7］，成人B-ALL患者高表达 LEF1预后不良［8］，正常核型AML患者LEF1高表达预后良好［9］等。急性白血病存在Wnt/β-catenin信号通路的异常激活［13-14］，该通路激活后β-catenin是否与LEF1结合发挥致白血病作用呢？为研究该问题，本文检测了AL患者β-catenin和LEF1的表达及相关性。结果显示，ALL患者βcatenin、LEF1 mRNA表达高于对照组，并且两者表达呈正相关，提示β-catenin/LEF1转录复合体可能在ALL发病中发挥作用。而AML则不然，与对照组相比，β-catenin mRNA表达增高，LEF1 mRNA表达降低，两个基因表达方向虽不同，但相关分析显示仍呈正相关。ALL患者LEF mRNA表达上调与JIA等［15］的研究结果一致。AML患者表达下调与GANDILLET等［16］的研究结果基本一致，该研究用qPCR方法检测了7例β-catenin表达较丰富的AML患者84个Wnt/β-catenin通路相关基因，与正常骨髓CD34+细胞相比，AML患者LEF1 mRNA表达下调。而FU等［17］的研究结果则相反，该研究比较了101例AML患者和20例健康对照LEF1 mRNA表达，显示AML患者高于对照组。METZELER等［9］、ALBANO等［18］分别研究了LEF1 mRNA表达对正常核型AML、急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia，APL）患者预后的影响，但均未与对照组比较（未设对照）。目前LEF1在AL中表达研究还较少，而且本实验、GANDILLET 等［16］和FU等［17］所设置的对照不同，依次为非恶性血液病和移植供着、正常骨髓CD34+细胞、健康人，因此LEF1在AML中的表达是上调还是下调尚难下定论。LEF1至少有2种剪接体，一种为全长型，具有转录激活作用；另一种为截短型（缺乏β-catenin结合位点），对转录具有抑制作用［7］。本实验PCR检测的是总LEF mRNA，FU等［17］未标明检测的转录本，METZELER 等［9］和 ALBANO 等［18］检测的也是总LEF mRNA，因此LEF1在AML患者表达研究还需增加全长型LEF检测更准确地进行。另外，本研究结果还显示THP-1细胞β-catenin、LEF1 mRNA表达方向基本与AML患者一致，可作为研究Wnt/β-catenin信号通路的AML细胞模型。

综上所述，AL患者有Wnt/β-catenin路通的异常激活，β-catenin/LEF1转录复合体可能在ALL发病中发挥作用，LEF1在AML中的表达还需扩大样本量、增加全长型LEF1检测、规范对照设置进一步研究。

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