硝苯吡啶在铁超载HK-2细胞氧化应激中的作用及机制

吕小梅 冉兵 杨茂 李雪森 蔺艳，

西南医科大学1生理学教研室，2肿瘤医学研究所（四川泸州 646000）

铁超载是铁代谢紊乱的一种病理表现，多种疾病如：小红细胞性贫血、溶血性贫血、肾炎综合征和多次输血等都可引起铁超载［1-3］。机体铁超载会引起过量的游离铁在肝脏、胰腺、心脏、脑垂体、肾脏等薄壁器官沉积，促进氧自由基的产生，并引起氧化应激等病理生理过程的发生［4］。用铁螯合剂降低血清及细胞内铁含量一直是临床治疗铁超载的主要方式。硝苯吡啶作为一种钙通道抑制剂在临床主要被用于高血压，冠心病等心血管疾病的治疗［5-7］，但近年来有研究［8］显示硝苯吡啶可抑制离体心肌和心室肌细胞L-型钙通道介导的非转铁蛋白结合铁的摄取，可显著刺激COS-7细胞和HEK293T细胞的铁转运，增加铁超载模型大鼠尿铁排泄［9］等，提示心肌或肾小管细胞摄取铁或与钙通道有关，有学者甚至提出或许可用钙通道抑制剂联合铁螯合剂来治疗心肌铁超载［8］。所以L-型钙通道抑制剂——硝苯吡啶在铁超载性疾病中的一些新的药理特性就越来越受到了人们的关注。但硝苯吡啶对铁超载肾小管细胞铁转运的作用机制是什么，一直都非常不清楚，硝苯吡啶对铁超载性氧化应激是否有作用亦未见报道，本研究用HK-2细胞为对象，研究硝苯吡啶对肾小管细胞氧化应激的作用及可能的机制，以期为探明硝苯吡啶在铁超载性疾病中的药理特性提供实验和理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料和试剂 HK-2细胞、FAC和Nifedipine购自上海延慕实业公司，CCK-8试剂盒购自Dojin，硝酸购自科龙试剂公司，普鲁士蓝伊红染色试剂盒购自北京solarbio试剂公司，总超氧化物歧化酶（T-SOD）、丙二醛（MDA）、还原性谷胱甘肽（GSH）均购自南京建成试剂公司，鼠抗人单克隆DMT1（ab117544）和羊抗人多克隆FPN1（ab205376）抗体购自Abcam公司，鼠抗人β-actin单克隆抗体和羊抗鼠荧光标记IgG抗体购自Gene公司，兔抗羊辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记IgG抗体购自北京博奥森生物技术有限公司，DAB显色试剂盒为购自MILLIPORE公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞分组及处理 将对数生长期的HK-2细胞随机分成4个组，分别为空白组、铁超载组、硝苯吡啶组、共处理组。铁超载组用柠檬酸铁铵（ferric ammonium citrate，FAC）300 μmol/L 处 理24 h，硝苯吡啶组用硝苯吡啶10 μmol/L处理24 h，共处理组用硝苯吡啶处理1 h后加入FAC共同处理24 h，空白组用等体积的溶剂处理。

1.2.2 氧化应激试验 收集分组处理好的细胞在冰上超声波破碎，功率80 W，超声时间5 s，间歇10 s，重复4次，获取细胞破碎液，按照试剂盒说明书用硫代巴比妥酸（TBA）法检测细胞内的MDA含量、羟胺法检测细胞内T-SOD活性、微量酶标法检测细胞内GSH的含量。

1.2.3 感应耦合等离子体原子发射光谱仪测细胞内铁含量 HK-2细胞照1.2.1的方法分组处理，每组8个复孔。消化收集细胞，细胞计数后，用PBS清洗3遍，每管加入纯硝酸200 μL，混匀，37℃过夜，用超纯水250倍稀释后，用感应耦合等离子体原子发射光谱仪在259.94 nm波长下测发射光强度，根据发射光强度与铁含量的标准曲和样品的发射光强度换算铁含量。仪器参数设置为：发射功率1 150 W，载气流量0.7 L/min，辅助气流量1.0 L/min，冷却气流量12 L/min。

1.2.4 Western blot法检测二价金属离子转运蛋白 1（divalent metal transporter 1，DMT1）和膜铁转运蛋白1（ferroportin，FPN1）的表达 收集分组处理的细胞蛋白样品。制取PAGE-SDS胶，分离胶10%，浓缩胶5%，每孔蛋白上样量60 μg，按Western blot常规方法操作，一抗用鼠抗人β-actin单克隆抗体（1∶2 000），羊抗人FPN1多克隆抗体（1∶500），鼠抗人DMT1多克隆抗体（1∶500），二抗用兔抗鼠荧光标记IgG（1∶5 000）和羊抗兔HRP标记IgG（1∶2 000），在成像仪下曝光成像。

1.3 统计学方法 数据采用SPSS 17.0软件进行统计处理，结果用x±s表示，多组比较采用单因素方差分析，组间各指标比较采用LSD法检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞MDA、SOD和GSH含量的比较用FAC处理HK-2细胞24 h后，与空白组相比，铁超载组细胞内MDA含量增多，SOD活性降低，GSH含量减少，差异具统计学意义（P＜0.05）。硝苯吡啶组MDA含量，SOD活性和GSH含量与空白组比较差异不具统计学意义（P＞0.05），但与铁超载组相比MDA含量降低，SOD活性增加，GSH含量增多，差异具统计学意义（P＜0.05）。共处理组与空白组相比，MDA含量增加（P＜0.05），SOD活性和GSH含量差异不具统计学意义（P＞0.05），但与铁超载组相比MDA含量降低，SOD活性增加，GSH含量增多，差异具统计学意义（P＜0.05，表1）。表明硝苯吡啶单独处理对MDA、SOD和GSH无显著影响，但能抑制FAC对MDA、SOD和GSH的影响。

表1 HK-2细胞中MDA、T-SOD、和GSH的含量Tab.1 The contents of MDA，T-SOD，and GSH in HK-2 cells（n=6） ± s

表1 HK-2细胞中MDA、T-SOD、和GSH的含量Tab.1 The contents of MDA，T-SOD，and GSH in HK-2 cells（n=6） ± s

注：与空白组相比较，*P＜0.05；与FAC组相比较，#P＜0.05

组别空白组铁超载组硝苯吡啶组共处理组MDA（nmol/mg prot）0.12±0.01 0.24±0.03*0.12±0.01#0.17±0.02*#T-SOD（U/mg prot）63.00±3.71 47.57±2.13*60.60±4.53#58.98±5.23#GSH（nmol/mg prot）71.76±7.57 56.54±6.57*69.82±7.26#68.76±6.35#

2.2 细胞内铁含量的比较 用FAC和（或）硝苯吡啶处理HK-2细胞24 h后，用感应耦合等离子体原子发射光谱仪测各组铁浓度，结果显示：铁超载组铁含量升高，硝苯吡啶组与空白组和铁超载组相比铁含量降低，共处理组与空白组相比铁含量升高，但与铁超载组相比铁含量降低，以上结果差异均具有统计学意义（P＜0.05，图1）。表明硝苯吡啶处理能降低HK-2细胞内铁含量。

2.3 各组细胞DMT1表达水平的比较 HK-2细胞分组处理后，用Western blot法检测DMT1的表达量。结果显示铁超载组DMT1的表达水平降低（P＜0.05），硝苯吡啶组的DMT1的水平升高（P＜0.05），共处理组与空白组相比DMT1表达水平无显著变化（P＞0.05），但与铁超载组相比DMT1表达水平明显升高（P＜0.05）。表明硝苯吡啶可增加HK-2细胞DMT1的表达量。见图2。

图1 各组细胞内铁含量的比较Fig.1 Iron contents in HK-2 cells

图2 DMT1在HK-2细胞中的表达Fig.2 Expression of DMT1 protein in HK-2 cells

2.4 各组细胞FPN1表达水平的比较 HK-2细胞分组处理后，用Western blot法检测FPN1的表达水平。结果显示与空白组相比铁超载组、硝苯吡啶组和共处理组FPN1的表达水平均升高（P＜0.05），硝苯吡啶组和共处理组与高铁组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。见图3。

3 讨论

图3 FPN1在HK-2细胞中的表达Fig.3 Expression of FPN1 protein in HK-2 cells

氧化应激（oxidative stress，OS）是指体内氧化-抗氧化反应失衡，ROS增多，对抗与清除氧自由基的能力减弱，细胞修复能力降低，膜脂质发生过氧化损害。MDA含量可反映细胞脂质过氧化损害的程度［10］，T-SOD和GSH可间接反应机体清除氧自由基的能力［11］。本研究用FAC处理HK-2细胞24 h所致铁超载模型细胞内MDA含量增加，T-SOD活性降低，GSH含量降低，表明铁超载可致细胞内发生氧化应激。硝苯吡啶单独处理时对MDA、SOD和GSH这几个指标无显著影响，但与FAC联合处理时细胞中MDA含量比铁超载组明显降低，SOD活性和GSH含量比铁超载组明显增加，表明硝苯吡啶本身并不能增加HK-2细胞抗氧化的能力，但能使FAC引起的细胞脂质过氧化损害明显减弱，在HK-2细胞铁超载促发的氧化应激中具有保护作用。

为了探明硝苯吡啶减轻HK-2细胞氧化应激性损伤的机制，本研究关注了硝苯吡啶对细胞内铁含量和铁代谢相关蛋白DMT1和FPN1的表达的影响。经典的铁转运途径是转铁蛋白-转铁蛋白受体（Tf-TfR）循环：血浆中Fe3+与转铁蛋白结合形成Tf-Fe3+，Tf-Fe3+与细胞膜上的TfR形成Tf-Fe3+-TfR复合物，经内吞作用进入细胞形成内吞小体（内涵体），在质子泵作用下，内吞小体PH值下降，Fe3+从Tf中释放出来，脱铁后的Tf被运回胞外，Fe以Fe2+的方式被内涵体膜上的DMT1转运至胞浆中，Fe2+或进入铁蛋白中储存，或进入线粒体参与代谢，或由FPN1转出细胞并被氧化成Fe3+重新回到血浆中［3］。此外少量Fe2+在心肌、肝脏、胰腺还可以通过L-型钙通道，DMT1，ZIP4等［12］方式被转运入细胞中。研究证实铁超载时，TfR表达下调［13］，经典的Tf-TfR途径铁转运减少，旁路途径增加，但具体哪些细胞各自有哪些途径和通道，目前并不十分清楚。本研究中硝苯吡啶作为一种L-型钙通道抑制剂显著降低HK-2细胞内铁含量，与DAS等［8］观察到的硝苯吡啶可减少大鼠心肌细胞通过L-型钙通道摄取铁的结果相似，提示HK-2细胞转运铁或许也有钙通道途径，硝苯吡啶可能是通过抑制钙通道而减少铁摄取，从而降低HK-2细胞内铁含量，但这一猜测和机制还需要更多的实验证据来阐明。

DMT1通常被认为是调节铁摄取的一个重要的转运蛋白，它在不同细胞不同部位具有不同的功能：（1）在肠腔上皮细胞刷状缘膜上介导Fe2+的摄取；（2）在外周神经系统和红细胞膜上负责非转铁蛋白结合铁（non-Tf-boundiron，NTBI）的吸收［14］；（3）在内涵体膜上负责将Fe2+转出到胞浆中［15］；（4）在线粒体外膜上负责将铁摄入线粒体中［16］。ABOUHAMED等［17］用荧光免疫染色的方法发现DMT1在肾近端小管上皮的表达主要位于晚期内涵体/溶酶体膜上，并不出现在细胞膜上，所以它似乎并不负责肾小管细胞摄取铁［17］，而是主要负责将晚期内涵体/溶酶体内的铁转运至胞浆中。本研究中硝苯吡啶促进HK-2细胞DMT1的表达，可增强细胞内的铁转运，亦将有利于逆转铁蓄积，减轻铁超载所引发的氧化应激性损伤。

FPN1是目前研究认为的唯一负责细胞内铁转出的蛋白［18］，在小肠、肝脏、脾、巨噬细胞和肾小管细胞中广泛表达［19］。FPN1在肾近端小管细胞的胞浆和靠近基底膜的部位表达［20］，可能与肾脏重吸收铁的功能相关［20］。本实验中硝苯吡啶增加铁输出蛋白FPN1的表达，将有利于增加铁的转出，帮助降低细胞内铁含量，从而减少铁超载促发的氧化应激性损伤。

综上所述，笔者认为硝苯吡啶在铁超载HK-2的氧化应激中有保护作用，这一作用与硝苯吡啶促进DMT1和FPN1的表达，增加细胞内铁的转运及转出，降低细胞内铁含量有关。了解和探明硝苯吡啶在铁超载肾小管细胞中的作用以及对铁代谢的影响机制将为临床用治疗铁超载性肾病提供新的思路和方法。

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