重组分泌型肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体腺病毒对PC-3细胞荷瘤鼠瘤体的生长抑制

高磊 潘铁军 谢鸣 蒋渊 喻希 李想

中国人民解放军武汉总医院泌尿外科（武汉 430070）

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand，TRAIL）被发现后，经过不断研究证实其在细胞凋亡中发挥重要作用。TRAIL能诱导多种肿瘤细胞的凋亡，被认为是一种很有前途的抗癌分子。我们前期成功构建了表达分泌型TRAIL基因的腺病毒载体Ad-sTRAIL，并且在体外实验中证实了Ad-sTRAIL可以抑制前列腺癌细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡。本研究试图探讨Ad-sTRAIL的体内抗肿瘤作用。

1 材料与方法

1.1 材料与分组

1.1.1 人前列腺癌细胞株 PC-3购于中国科学院上海细胞库。Ad-LacZ病毒，Ad-sTRAIL病毒均由本科构建保存。鼠抗人TRAIL单克隆抗体及兔抗鼠荧光素标记二抗均购自Santa公司。新生牛血清购于北京四季青生物技术公司；RPMI 1640细胞培养基（Gibco BRL公司）。DAPI染色液购于Beyotime公司。TUNEL检测试剂盒购于Roche公司。本研究起止时间为2015年3月至2016年10月。

1.1.2 分组 Control组：常规培养的PC-3细胞；Ad-LacZ组：40 MOI的Ad-LacZ感染的PC-3细胞；Ad-sTRAIL组：40 MOI的Ad-sTRAIL感染的PC-3细胞。

1.2 方法

1.2.1 DAPI染色检测细胞凋亡 高压消毒后无菌盖玻片置于24孔板中，取细胞浓度5×105/mL，每孔300 μL，接种后每24小时分别以40 MOI的Ad-LacZ和Ad-sTRAIL感染相应分组细胞，继续常规培养48 h。以4%多聚甲醛固定爬片，经0.1%Triton PBS作用5 min，0.01 mol/L PBS溶液洗涤，滴加DAPI染液染色10 min，流水冲去染液，滤纸吸除多余水分，加一滴荧光封片液，荧光显微镜观察并拍照。

1.2.2 Transwell实验 采用孔径为8 μm的24孔Borden小室（美国BD公司）进行实验。先用无血清培养液冲洗小室上室2次，然后加入1∶8稀释的Matrigel胶（美国BD公司）50 μL，37℃孵育30 min制作人工基底膜。以无血清培养基调整细胞密度为2 × 105个/mL，上室加入细胞悬液200 μL，下室加入600 μL含10%胎牛血清的培养液，37℃培养72 h后以Giemsa染色观察穿入下室面的细胞数。

1.2.3 体内抗肿瘤实验 PC-3细胞接种于雄性BALB/c裸鼠右侧腋窝皮下（第四军医大学实验动物中心提供）。待瘤块长至足够大时，取新鲜肿瘤组织在生理盐水中剪成3 mm×3 mm×3 mm大小的小块接种裸鼠右侧背部，选取荷瘤成功的裸鼠18只；随机分为3组，每组6只，分别为对照组、Ad-LacZ组和Ad-sTRAIL组。实验开始后7、14 d给药，共给药2次。每3天测量1次瘤体的长径（a）和短径（b），按肿瘤体积V=a×b2/2。共观察21 d，依据肿瘤体积计算肿瘤抑瘤率（%）=1-实验组肿瘤体积/对照组肿瘤体积。

1.2.4 荷瘤组织免疫组化 4%多聚甲醛固定，制作蜡块、切片、贴片；用二甲苯浸洗2次，每次5 min；用梯度乙醇（100%、95%、90%、80%、70%）各浸洗1次，每次3 min。PBS清洗；加入0.3%的过氧化氢甲醇溶液30 min，PBS清洗5 min×3；0.3%Triton×100处理30 min，PBS清洗5 min×3。加入1∶500稀释的鼠抗人TRAIL单克隆抗体，4℃存放24 h；吸去抗体，PBS清洗5 min×3。加入PBS稀释的以生物素标记的兔抗鼠二抗，室温孵育2 h。PBS清洗5 min×3。加入ABC复合物，室温孵育2 h，PBS清洗5 min×3；蒸馏水迅速冲3次。加入DAB显色10 min，用蒸馏水迅速冲洗，苏木素复染30 s；梯度酒精脱水之后，封片，拍照。

1.2.5 荷瘤组织TUNEL染色 4%多聚甲醛固定，制作蜡块、切片、贴片；用二甲苯及梯度乙醇；PBS漂洗3次；用Proteinase K工作液处理组织15 min在37℃；PBS漂洗3次；加50 μL TUNEL反应混合液于标本上，加盖玻片反应37℃×1 h。PBS漂洗3次；加50 μL converter-POD于标本上，加盖玻片反应37℃×30 min。PBS漂洗3次；在组织处加100 μL DAB底物，反应25℃×10 min；PBS漂洗3次；拍照后再用苏木素复染30 s。梯度酒精脱水之后，封片，拍照。

1.3 统计学方法 采用SPSS 18.0进行统计学分析，结果中定量数据用±s表示，均数间的两两比较采用SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DAPI染色 Ad-sTRAIL组肿瘤细胞凋亡水平明显高于Control组和Ad-LacZ组。Ad-sTRAIL组肿瘤细胞出现皱缩，胞浆致密，核染色质边集，并且胞核裂解，形成含核碎片和细胞器成份的凋亡小体（图1）。

2.2 TranswellAd-sTRAIL组穿入下室面的细胞数（24.8±3.70）明显少于对照组（47.6±4.28，q=10.68，P＜0.01）及Ad-LacZ组（49.6±4.39，q=11.61，P＜0.01）。见图2。

2.3 体内抗肿瘤实验 与Control组和Ad-LacZ组的细胞相比，Ad-sTRAIL组的荷瘤鼠肿瘤生长能力显著降低（图3）。经计算后可见Ad-sTRAIL对荷瘤鼠肿瘤的抑制率3 d为8.15%（P＜0.05），6 d为11.55%（P＜0.01），9 d为17.23%（P＜0.01），12 d为20.05%（P＜0.01），15 d为27.18%（P＜0.01），18 d为34.27%（P＜0.01），21 d为33.08%（P＜0.01），随时间抑制作用逐渐增强。

图1 Ad-sTRAIL对PC-3细胞凋亡的影响（×200）Fig.1 The effects of Ad-sTRAIL on PC-3 cells apoptosis（× 200）

图2 Ad-sTRAIL对PC-3细胞侵袭能力的影响（×200）Fig.2 The effects of Ad-sTRAIL on PC-3 cells invasion（× 200）

图3 Ad-sTRAIL对荷瘤鼠肿瘤增殖能力的影响Fig.3 The effects of Ad-sTRAIL on the tumor proliferation of tumor-bearing mice

2.4 免疫组化实验 Ad-sTRAIL组荷瘤鼠肿瘤组织中TRAIL表达水平明显高于Control组和Ad-LacZ组（图4）。TUNEL实验显示：Ad-sTRAIL组荷瘤鼠肿瘤细胞核染色明显，表明该组细胞凋亡水平明显高于Control组和Ad-LacZ组（图5）。

3 讨论

前列腺癌是男性生殖系统常见的恶性肿瘤。在北美和欧洲国家中，前列腺癌为男性的第二大恶性肿瘤，在我国的发病率也有明显增加的趋势［1］。目前，对于伴发转移的难治性前列腺癌主要的治疗方法是化疗。但由于前列腺癌属于对化疗不敏感的肿瘤，并常产生耐药性，所以常规化疗很难达到令人满意的治疗效果。随着对肿瘤发病机制的不断研究，基因治疗已成为前列腺癌治疗的重要方法［2］。

TRAIL是肿瘤坏死因子家族的新成员，其可诱导肿瘤细胞发生凋亡等，但对正常的细胞却无影响［3］。有研究表明：TRAIL可以抑制人肺癌细胞的增殖，促进肿瘤细胞凋亡；并且当TRAIL与格列吡嗪联合应用时可以发挥更好的抗肿瘤效果［4］。同时，TRAIL在小细胞肺癌和肝癌中发挥重要作用，其主要是通过活化Caspase-8达到促进肿瘤细胞凋亡的效果。但TRAIL的促凋亡作用可被DNA损伤诱导凋亡抑制因子（DNA damage-induced apoptosis suppressor，DDIAS）减弱［5］。此外，TRAIL可与结肠癌细胞中的死亡受体结合，活化Fas相关的死亡结构域蛋白（Fas associated death domain protein，FADD），从而促进结肠癌细胞凋亡。并且，TRAIL与热休克蛋白90（heat shock protein 90，Hsp90）联合应用可以进一步增强其促凋亡作用［6］。大量研究表明TRAIL可以诱导多种肿瘤细胞凋亡［7］。作为肿瘤坏死因子家族TNF相关的凋亡诱导配体，TRAIL可与死亡受体（TRAIL-R1和TRAIL-R2）结合，激活Caspase信号通路，进而引起细胞凋亡。TRAIL-R2在前列腺癌中高表达，特别是晚期前列腺癌［8］。因此前列腺癌细胞对TRAIL反应敏感，所以构建表达TRAIL的腺病毒用于治疗前列腺癌存在理论基础［9］。本研究成功构建了表达分泌型TRAIL基因的腺病毒载体Ad-sTRAIL；并以该载体感染前列腺癌细胞株PC-3，结果表明经Ad-sTRAIL感染组肿瘤细胞凋亡水平明显增加；同时Ad-sTRAIL还抑制了PC3细胞的侵袭能力。TRAIL蛋白表达水平增加导致其与死亡受体结合增加，诱导胞内死亡结构域变构，从而催化裂解Caspase-8前体，激活形成活化型Caspase-8，进一步放大凋亡信号以诱导细胞死亡。进一步的实验也验证了这一结论，DAPI染色显示Ad-sTRAIL感染前列腺癌细胞后，肿瘤细胞凋亡水平显著提升，出现皱缩，胞浆致密，核染色质边集，并且胞核裂解，形成含核碎片和细胞器成份的凋亡小体。另外，Transwell试验结果显示Ad-sTRAIL感染后细胞侵袭转移的能力明显降低。进一步荷瘤鼠实验表明，Ad-sTRAIL组的荷瘤鼠肿瘤生长能力显著降低，证明Ad-sTRAIL在体内亦能发挥抑制肿瘤生长的作用。免疫组化实验及TUNEL实验证实，荷瘤鼠肿瘤组织中TRAIL表达水平的增加导致了肿瘤细胞凋亡水平的增加。

图4 TRAIL蛋白在3组荷瘤鼠肿瘤组织中的表达（×200）Fig.4 The expression of TRAIL protein in tumors of three groups tumor-bearing mice（× 200）

图5 Ad-sTRAIL对3组荷瘤鼠肿瘤细胞凋亡的影响（×200）Fig.5 The effects of Ad-sTRAIL on tumor cells apoptosis of three groups tumor-bearing mice（× 200）

综上所述，通过提高TRAIL的表达在体内外均可以抑制PC-3细胞增殖，促进细胞凋亡；其具体机制可能是通过增加前列腺癌细胞中TRAIL的表达来活化Caspase-3和Caspase-8达到促进前列腺癌细胞凋亡的作用。本研究成功在体内实验中验证了Ad-sTRAIL抗肿瘤效果，为下一步的临床抗肿瘤研究奠定了基础。

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［5］KIM B K，LEE J Y，PARK S H，et al.DDIAS suppresses TRAIL-mediated apoptosis by inhibiting DISC formation and destabilizing Caspase-8 in cancer cells［J］.Oncogene，2017，10（15）：1038-1046.

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