间充质干细胞源性外泌体提取鉴定方法研究

杨 前 甘国胜 袁紫林 王 刚 陈 力 闫德祺 张 宜 刁 波

(中国人民解放军武汉总医院医学实验科 武汉 430000)

干细胞外泌体是MSCs在病理或者生理状态下分泌的直径约30～100 nm的膜性小囊泡，含有蛋白质、mRNA等活性成分，有研究表明干细胞外泌体能一定程度上模拟MSC的生物学功能，具有广阔的应用前景[1～2]。本课题将应用二次提取法提高外泌体的纯度，为准确的开展其他实验提供依据。

1 材料与方法

1.1 仪器及试剂

CD31、CD73、CD29、CD81、CD63(BD); 外泌体提取试剂盒(invitrogen);高速离心机(Sigma); FACsAria流式细胞仪 (BD)；透射电镜(Philips)。

1.2 脐带间充质干细胞培养及鉴定

无菌操作将脐带剪碎，分离出沃顿胶，接种至培养皿中，加入干细胞培养基，待细胞集落长满后，消化传代；取状态良好的P3代细胞悬液50μl，加入10μlCD31、CD73、DRPerCP及5μlCD29，避光孵育15min,1000r/min，离心5min,沉淀500μlPBS重悬，流式检测。

1.3 干细胞外泌体提取

将MSCs无血清空培养24h，取5ml上清，2000G离心30min，取上清，加入1/2体积外泌体提取液，4 ℃过夜，第2天10000G，4 ℃离心60min，取部分沉淀，凝胶电泳及BCA检测；剩余沉淀重悬PBS中，再次加入1/2体积外泌体提取液，4℃静置12H及24H，10000G，4 ℃离心60min，弃上清，再次取出部分沉淀凝胶电泳及BCA检测，其余-80℃冻存。

1.4 凝胶电泳法及BCA蛋白定量法检测外泌体纯度及浓度

分别将两次提取的蛋白样品用上样缓冲液稀释，沸水浴5min，灌胶，上样，并加入20μl蛋白Marker对照，电泳(2～3H)；染色4～6h；脱色；凝胶摄像分析；同时将适量两次次提取的样品液加入96孔板中，标准品稀释至20μl；各孔加入200μl BCA工作液,37℃避光20min；562nm，测OD值；计算蛋白浓度。

1.5 电镜观察外泌体形态

取外泌体悬液20μl，滴于载样铜网上，室温静置1min，自然干燥，滴加20g/L磷钨酸负染1min,滤纸吸干残留液，白炽灯下烤10min，电镜观察拍照。

1.6 流式检测外泌体

将20 μl CD63和5μlCD81加入100μl外泌体悬液中，混匀，4 ℃避光孵育30min，用同型不加抗体的外泌体悬液作阴性对照，流式检测。

2 结果

2.1 huc-MSCs流式检测

脐带干细胞呈现CD73(+)、CD29(+)、CD31(-)、HLA-DR-Per-CP(-)纯度和活性都比较高的特征(图1)。

图1 huc-MSCs表面标志物流式检测

2.2 凝胶电泳法及BCA蛋白定量法检测蛋白纯度及浓度

外泌体经一次提取后，杂蛋白条带非常多，纯度低，而二次提取后杂蛋白少了很多，纯度提高(图2)；QuantityOne软件分析得出蛋白条带灰度值(图2-C)；GraphPad Prism 7 软件分析数值并计算得出一次提取与二次提取12H及24H(P<0.01)，均存在显著性差异(图2-D)；BCA蛋白定量法得出，一次提取后外泌体蛋白含量为15.49ug/ml；二次提取后平均含量为3.48ug/ml；杂蛋白去除，外泌体纯度提高。

2.3 间充质干细胞外泌体电镜观察

MSCs外泌体呈圆形或椭圆形的小囊泡，囊泡外周可见膜性结构，大小具有较明显的异质性，直径为30～100nm，腔内部显示低电子密度成分(图3)。

2.4 间充质干细胞外泌体流式检测

MSCs外泌体空白对照组没有检测出CD63、CD81蛋白，实验组则高表达CD63、CD81蛋白(图4)。

A

B

C

D

注：A图表示一次提取后，1、2、3、4四个重复样本杂蛋白条带都非常多；B图二次提取电泳图，1、2、3图是加入提取液静置12H， 4、5、6是静置24H，杂蛋白条带明显降低。

图3 外泌体电镜形态

A 空白对照

B huc-MSC外泌体

3 讨论

MSCs是一类具有自我复制及多向分化潜能的祖细胞，具有组织修复、免疫调节等作用，为当今自然科学领域研究的热点问题。以往总认为其治疗潜能是由于MSC归巢分化、替代原来的损伤组织，直至2010年Lai等[3]通过分离MSC以内分泌和旁分泌的方式分泌的起修复作用的营养因子，首次证实为MSCs外泌体。有研究证实外泌体参与一系列生物过程，如免疫应答、血管生成、炎症反应、抗原提呈等[4]，在减少心肌损伤、促进心血管再生、调节免疫系统、促进神经再生等方面有重要作用[5]。由此可见准确的提取鉴定外泌体的方法尤为重要，本课题应用试剂盒二次提取纯化外泌体，大大提高外泌体的纯度，为准确开展后续实验研究提供有力科学依据。

1 Ailawadi S,Wang X,Gu H,et al. Pathologic Function and Therapeutic Potential of Exosomes in Cardiovascular Disease.Biochim Biophys Acta,2015,1852(1):1～11.

2 Huang L,Ma W,Ma Y,et al．Exosomes in Mesenchymal Stem Cells,a New Therapeutic Strategy for Cardiovascular Diseases.Int J Bid Sci,2015,11(2):238～245.

3 Lai RC,ArsIan F,Lee MM,et al.Exosome Secreted by MSC Reduces Myocardial Ischemia Reperfusion Injury.Stem Cell Res,2010,4(3):214～222.

4 Sun L,Xu R,Sun X,et al.Safety Evaluation of Exosomes Derived from Human Umbilical Cord Mesenchymal Stromal Cell.Cytotherapy,2016,18(3):413～422.

5 Kariminekoo S,Movassaghpour A,et al.Implications of Mesenchymal Stem Cells in Regenerative Medicine.Artif Cells Nanomed Biotechnol,2016,44(3):749～757.