雷帕霉素调剂对神经内分泌肿瘤组织中Caspase-9和Ki-67表达水平的影响

邓海华 马国祥 丁西萍 杨振汉

深圳市宝安区福永人民医院内科，广东 深圳 518103

神经内分泌肿瘤属于神经系统肿瘤之一，该疾病严重威胁患者的生命安全[1-2]。雷帕霉素是临床常用的化疗药物之一，然而，雷帕霉素治疗神经内分泌肿瘤的分子机制尚有待进一步探讨[3]。Caspase-9和Ki-67在神经内分泌瘤的发生，发展和预后中具有重要作用。Ki-67(nuclear-associated antigen，Ki-67)是细胞内与细胞增殖密切相关的蛋白分子[4]。在肿瘤细胞中，Ki-67的表达水平显著高于非肿瘤细胞。Caspase-9是细胞凋亡的重要分子，在细胞凋亡的执行过程中发挥关键作用[5-6]。在肿瘤细胞中，细胞凋亡被抑制，Caspase-9的水平和活性也被抑制[7-8]。然而，Caspase-9和Ki-67在不同发展阶段神经内分泌肿瘤细胞中的水平尚需进一步探讨[9]。

1 实验试剂和方法

1.1实验试剂DAB酶底物显色试剂盒购自北京鼎国生物技术股份有限公司。小鼠抗人Caspase-9多克隆抗体和小鼠抗人Ki67多克隆抗体都购自于美国Sigma生物技术有限公司。S-P免疫组化试剂盒购买于上海生物工程有限责任公司。其他试剂均购自碧云天生物技术研究所。

1.2研究病例本实验中的488例神经内分泌肿瘤患者都来源于深圳市宝安区福永人民医院肿瘤科自2013-07—2016-09接受手术治疗的患者，发病部位为胃、肠、胰腺消化系统神经内分泌肿瘤。488例神经内分泌肿瘤患者被随机分为对照组(未使用雷帕霉素244例)和雷帕霉素干预组(244例)。488例神经内分泌肿瘤患者，女264例，男224例，年龄18～70岁，平均46.6岁。按照2016年世界卫生组织对神经内分泌肿瘤的分级标准，患者分为6级[12]，其中1级56例，2级72例，3级128例，4级80例，5级80例，6级72例。治疗方法是雷帕霉素的靶向药物治疗。所有病例的入选标准和排除标准都按照文献报道的方法[10-11]进行，同时经病理学验证和确诊。本研究经深圳市宝安区福永人民医院伦理委员会的批准，神经内分泌肿瘤患者均签署了知情同意书。

1.3免疫组化的检测方法采用SP染色法对神经内分泌肿瘤组织和对照组织进行免疫组化分析[13-14]。

1.4免疫组化阳性结果的认定免疫组化阳性结果的判定由3由经验丰富的三位病理学专家独立进行[15-16]。判定标准如下：没有被染色定为0分，染色为淡黄色为1分，染色为棕黄色为2分，染色为棕褐色为3分。阳性细胞的定义：51%～75%的细胞阳性为4分，75%～90%的细胞阳性为5分，>90%的细胞阳性为6分。

1.5免疫印迹Western blot方法按照文献报道[17]的方法进行免疫印迹实验。首先，采集神经内分泌肿瘤患者的肿瘤组织及对照组织，使用组织裂解液裂解组织，制备组织蛋白样品，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束进行转膜，分别孵育抗Caspase-9和Ki-67的一抗，洗涤后再孵育二抗，最后进行显影，定影。使用BandScan 软件对电泳结果进行灰度值分析[18-20]。Caspase-9和Ki-67蛋白的灰度值比上内参β-actin的灰度值，分别作为Caspase-9和Ki-67的蛋白相对表达量。

1.6统计处理方法本文数据使用SPSS 13.0软件分析。在相关性分析中，使用Spearman进行。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Ki-67在不同发展阶段神经内分泌肿瘤组织中的表达水平和分布Ki-67在不同发展阶段神经内分泌肿瘤组织中的表达水平和分布的分析结果如图1所示：神经内分泌肿瘤组织的免疫组化染色的阳性染色呈棕紫色或紫色，为颗粒状分布，Ki-67在神经内分泌肿瘤中上皮细胞的细胞核中具有显著的表达和分布(见表1～2)。

表1 Ki-67在不同发展阶段的各级神经内分泌肿瘤组织中的表达

表2 Ki-67在不同程度分级中的表达情况

2.2 Caspase-9在神经内分泌肿瘤组织的免疫组化染色的阳性染色和分析结果Caspase-9在不同发展阶段神经内分泌肿瘤组织中的表达水平和分布的分析结果如下(如图2所示)：神经内分泌肿瘤组织的免疫组化染色的阳性染色呈红色或紫红色，为颗粒状分布，Caspase-9在神经内分泌肿瘤中上皮细胞的细胞核和细胞质中具有显著的表达和分布。从1级到6级的分级中，神经内分泌肿瘤患者中Caspase-9阳性表达率依次分别为70.5%，65.7%，67.8%，41.2%，18.8%和10.1%，组间各级别的差异具有统计学意义(P<0.05)(χ2=10.3)(见表3～4)。

图1 Ki-67在不同发展阶段神经内分泌肿瘤组织中的表达水平和分布的分析结果 神经内分泌肿瘤组织的免疫组化染色的阳性染色和分析结果，染色呈棕紫色或紫色 图2 神经内分泌肿瘤组织的免疫组化染色的阳性染色和分析结果 神经内分泌肿瘤组织的免疫组化染色的阳性染色和分析结果，染色呈棕紫色或紫色

表3 Caspase-9在神经内分泌肿瘤组织的免疫组化染色的阳性染色和分析结果 [n(%)]

表4 Caspase-9在不同程度肿瘤分级中的表达 (n)

2.3神经内分泌肿瘤组织中Caspase-9和Ki-67表达水平的相关性分析结果本研究分析了Caspase-9和Ki-67表达水平的相关性，结果提示，在低分化阶段的神经内分泌肿瘤组织中，Caspase-9和Ki-67表达水平的相关系数无统计学意义(表5)。在中高分级的级阶段神经内分泌肿瘤组织中，Caspase-9和Ki-67表达水平的相关系数具有统计学意义(见表5～6)。

2.4神经内分泌肿瘤组织中Caspase-9和Ki-67表达的结果本研究使用western blot检测了神经内分泌癌旁组织和肿瘤组织中Caspase-9和Ki-67的表达水平。图3中结果显示，神经内分泌肿瘤组织中Ki-67的蛋白表达水平高于癌旁组织，差异具有显著性。图4中结果显示，神经内分泌肿瘤组织中Caspase-9的蛋白表达水平高于癌旁组织，差异具有显著性。

表5 神经内分泌肿瘤组织中Caspase-9和Ki-67表达水平的相关性分析结果 (n)

表6 Caspase-9和Ki-67在中高级分化阶段神经内分泌肿瘤组织中表达水平的关系 (n)

图3 神经内分泌肿瘤组织中Ki-67表达的结果注：A是Ki-67表达的western blot结果，B是三次不同实验的统计学结果图4 神经内分泌肿瘤组织中Caspase-9表达的结果注：A是Caspase-9表达水平的western blot的分析结果，B是三次不同实验的统计学结果

2.5经雷帕霉素治疗后，神经内分泌肿瘤组织中Caspase-9的表达水平的结果图5～6中数据显示，神经内分泌肿瘤患者经雷帕霉素治疗后，Caspase-9的表达水平显著上升，Ki-67的表达水平显著下降，与未经雷帕霉素治疗组相比，差异具有统计学意义(P<0.05)，这暗示，雷帕霉素可能是通过引起肿瘤细胞发生凋亡而发挥其抗肿瘤作用的。

图5 雷帕霉素治疗后神经内分泌肿瘤组织中Ki-67表达水平的结果 图6 雷帕霉素治疗后神经内分泌肿瘤组织中Caspase-9表达水平的结果

3 讨论

神经内分泌肿瘤是神经系统重要的肿瘤之一，随着老龄社会的到来，神经内分泌肿瘤的发病率及病死率都出现增加的趋势，该疾病严重威胁着患者的生命[21-22]。Caspase-9和Ki-67在神经内分泌瘤的发生，发展和预后中具有重要作用[23]。雷帕霉素是临床上治疗肿瘤的一线药物之一，而其在神经内分泌肿瘤中的治疗机制尚有待进一步探讨[24]。

本研究主要结果如下：(1)免疫组织化学的结果表明，神经内分泌肿瘤患者不同分化情况如下：从1级到6级的分级中，神经内分泌肿瘤患者中Caspase-9阳性表达率依次分别为70.5%，65.7%，67.8%，41.2%，18.8%和10.1%，组间各级别的差异具有统计学意义(P<0.05)。神经内分泌肿瘤患者中Ki-67阳性表达率依次分别为13.3%，21.2%，36.5%，58.8%，68.8%和76.8%，组间各级别差异具有统计学意义(P<0.05)。这与以往的研究结果是高度相符[25-26]，即肿瘤细胞增殖速度增加，细胞凋亡被抑制。(2)Caspase-9和Ki-67的表达水平之间具有明显的相关性(P<0.05)。(3)经雷帕霉素治疗后，Caspase-9的表达水平显著上升，Ki-67的表达水平显著下降，与未经雷帕霉素治疗组相比，差异具有统计学意义(P<0.05)。这更支持了前人的研究[27-28]，即雷帕霉素发挥抗肿瘤作用主要是通过抑制细胞增殖及促进细胞凋亡实现的。这些结果表明，在神经内分泌肿瘤的进展过程中，Caspase-9的表达水平降低，Ki-67的表达水平增加，提示神经内分泌肿瘤细胞增殖加速，凋亡减少。经雷帕霉素治疗后，Caspase-9的表达水平增加，Ki-67的表达水平降低，这表明，雷帕霉素可能通过调节Caspase-9和Ki-67的表达水平而发挥其抗肿瘤作用。

本文尚有不足之处，具体表现如下：(1)本研究中的临床患者病例仅有488个，结果尚需要进一步验证。(2)本研究缺少雷帕霉素是如何调节Caspase-9和Ki-67表达水平的。(3)本研究缺少神经内分泌肿瘤大鼠或小鼠的动物模型，使用敲低或过表达Caspase-9和Ki-67进一步研究其表达水平与神经内分泌肿瘤的关系。

总之，本文数据提示，在神经内分泌肿瘤的进展过程中，Caspase-9的表达水平降低，Ki-67的表达水平增加，提示神经内分泌肿瘤细胞增殖加速，凋亡减少。经雷帕霉素治疗后，Caspase-9的表达水平增加，Ki-67的表达水平降低，这表明雷帕霉素可能通过调节Caspase-9和Ki-67的表达水平而发挥其抗肿瘤作用。本研究数据还提示，Caspase-9和Ki-67可能是神经内分泌肿瘤患者检测和预后的可能的分子标记物。

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