白细胞介素-27基因多态性与结核性胸腔积液的相关性分析

黄娜 魏明莉 王贝 李万成

在临床上有很多原因都可能引起胸腔积液，而结核性胸腔积液是胸腔积液中最常见的原因之一。白介素-27(interleukin-27, IL-27)属于IL-12家族中的一员[1]，是免疫介导炎症性疾病的一个重要的介质。在炎症反应的初期IL-27是促进T辅助细胞1(helper T cell1, Th1)应答和γ-干扰素(interferon-γ, IFN-γ)生成的主要因素，而在炎症反应的晚期则起着相对次要的免疫调控作用。IL-12是一个异二聚体抗炎症反应的细胞因子，由IL-12A和IL-12B分别编码p35和p40的两个亚单位构成。p40亚单位的表达受活化的巨噬细胞严格的调控和制约。研究表明IL-27在炎症性疾病、抗肿瘤、自身免疫性疾病和寄生虫感染中起到关键作用[2]。目前，有关IL-27基因多态性与结核性胸腔积液的文献罕有报道。为此，我们采用PCR/RFLP的方法，分析IL-27基因多态性与结核性胸腔积液的相关性，报道如下。

材料与方法

一、研究对象

选取2015年1月至2016年12月在成都医学院第一附属医院呼吸内科就诊且经胸腔镜病理确诊的汉族结核性胸腔积液患者160名，男87例，女73例；年龄( 24.2±5.7) 岁。选择190名健康对照体检者为对照组，男102例、女88例，年龄( 25.3±6.4) 岁。两组之间在性别、年龄上差异无统计学意义。

二、研究方法

1. 基因组DNA的提取： 每位受试者签订知情同意书后，采集(包括结核性胸腔积液患者和健康对照体检者)静脉血约4ml，EDTA-Na抗凝，提取基因组DNA后，-20 ℃保存备用。

2. PCR扩增、PCR-RFLP及测序分析： 查阅相关文献并根据Genbank dbSNP数据库中核对序列，选取了IL-27其3个位点，编号分别为： rs181206、rs153109和rs17855750(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)。PCR引物的设计参照genebank数据库提供的全序列，运用引物设计软件进行设计并合成各位点所需引物及其内切酶[3]。用于扩增IL-27 -964A /G(rs153109)，上游引物序列F:5′-TTGACGTCTCGTGAACTAGCCAG-3′，下游引物序列R:5′-TCTCATGACCACTCGAGCTAG-3′；用于扩增IL-27 4730T / C(rs181206)的上游引物序列F: 5′-GCGATACCGCCTCAGCTCT-3′，下游引物序列R:5′-CCTTCGAAGAGAGGTCCACG-3′；用于扩增IL-27 2905T /G(rs17855750)上游引物序列F: 5′-CAGCAGCTCCAGCTGGCAGC-3′，下游引物序列R:5′-AGCTGTTCGGCGAGACGTATA-3′。PCR反应体系总体积为25 μl，94 ℃预变性5 min, 94 ℃变性30 s, 62 ℃退火40 s, 72 ℃延伸40 s, 共30 个循环, 72 ℃终末延伸5 min RFLP反应体系总体积10 μl，ddH2O 6.6 μl ，PCR产物2 μl，内切酶0.4 μl(IL-27-964A /G、4730T/C和2905T /G均选用的XhoⅠ内切酶)。最后将PCR产物送测序，进一步明确基因型， 3个位点的PCR产物大小分别为119 bp 、132 bp、120 bp。

三、统计学方法

采用SPSS22.0统计学软件进行统计分析。基因型和等位基因频率均应用直接计数法。计数资料采用χ2检验进行单因素分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

各基因型和等位基因频率确认符合Hardy-weinberg遗传平衡定律。本组160名结核性胸腔积液患者和190名健康对照者进行基因型和等位基因频率检测，在结核胸腔积液组和对照组之间，IL-27-964A/G位点基因型分布频率有显著差异(P=0.000), 结核性胸腔积液组AA基因型频率(48.1%)明显高于对照组(26.8%), 结核性胸腔积液组-964A等位基因频率(66.3%)明显高于对照组(55.8%)(P=0.000)。在结核性胸腔积液组和健康对照组之间，IL-27-964A/G的基因型和等位基因频率的差异有统计学意义(P均<0.05)。而IL-27 4730T/C和2905T/G基因型和等位基因频率差异无统计学意义(P均>0.05)，见表1。

表1 结核性胸腔积液组与健康对照组基因型及等位基因频率[n(%)]

讨 论

IL-27主要由抗原提呈细胞(antigen presenting cell, APC)产生，具有抗炎症反应[4]和抗肿瘤免疫等多种生物学功能。IL-12激发许多生物反应：它既可以刺激活化的NK细胞和T细胞增殖，又可以提高NK细胞和T细胞介导的细胞生物活性，从而诱导IFN-γ的生成。研究表明在肿瘤组织和自身免疫性疾病中IL-27表达明显增高，且其增高的程度与疾病的严重程度密切相关[5-7]。在感染炎性反应早期IL-27既可以直接参与Th1细胞分化，又可以刺激T细胞活化增生产生IFN-γ等细胞因子，促进Thl型免疫反应[8]。IL-27信号转导分子STAT1和STAT3通过Janus激酶(Januskinase, JAK)家族转导蛋白STAT信号通路的激活而传递，发挥主要作用的信号通路是JAK1/STAT1和JAK1/STAT3。IL-27和WSX-1/gp130受体复合物结合后激活JAK1/STAT1、JAK1/STAT3信号转导通路，从而发挥相应的生物学作用。激活STAT1对Th1细胞的增殖分化具有主要作用，而STAT3具有抑制细胞因子产生的作用，虽然STAT3活化可激活下游IL-6R起到促进炎症反应作用，但同时可激活IL-10R发挥抑制炎症反应作用，而且IL-27作用于初始CD4+T细胞，短暂激活STAT1和STAT3，诱导Th1型免疫反应过程，但是，对于活化的CD4+T细胞，经过IL-27作用，STAT3可持续被激活，从而起到免疫抑制的作用；而此时STAT1的作用却并不明显。故认为STAT3的短暂激活具有促炎作用，而持续激活具有免疫抑制作用。

罗俊华等[9]研究发现IL-27在结核性胸腔积液的炎性反应中起到重要作用，有可能成为鉴别结核性胸腔积液和恶性胸腔积液一项重要指标，联合检测IL-27与INF-γ、ADA能进一步提高结核性胸腔积液诊断效率。战玉助等[10]研究表明IL-27 -964A/G基因多态性可能与结核病易感性密切相关。这些研究结果与我们的研究结果基本一致。

本文采用了病例对照的方法客观的评价了IL-27基因对结核性胸腔积液的遗传易感性的影响，发现IL-27 -964A/G基因型和等位基因频率在结核性胸腔积液组和对照组之间差异有统计学意义，这表明IL-27-964A/G基因是结核性胸腔积液的遗传易感基因。而IL-27 2905T/G、4730T/C 两个位点的基因型和等位基因频率在结核性胸腔积液组和对照组之间差异无统计学意义，说明这两个位点的基因多态性与结核性胸腔积液无相关性，因此这两个位点可能不是结核性胸腔积液易感性的相关位点。本研究发现，IL-27-964A/G基因多态性可能与结核性胸腔积液遗传易感性有关，这与文献研究基本一致[9-10]，因此IL-27可能在结核性胸腔积液的发生、发展中起到了一定的作用。当然，本研究样本量较少，尚需要大样本的数据进行进一步的统计分析证实IL-27-964A/G基因多态性与结核性胸腔积液的相关性。

综上所述，IL-27在结核病的发生、发展中起到了重要作用，从遗传学的角度来讲，有利于结核易感人群的筛查。

参 考 文 献

1 李敬萍, 关键, 许西琳, 等. IL-27在结核性胸膜炎胸水中的表达及其意义[J]. 吉林医学, 2013, 34(19): 3752-3754.

2 Yoshimoto T, Chiba Y, Furusawa J, et al. Potential clinical application of interleukin-27 as an antitumor agent[J]. Cancer Sci, 2015, 106(9): 1103-1110.

3 黄娜, 姜轶, 杨帆, 等. IL-27基因多态性与慢性阻塞性肺疾病相关性的研究[J]. 临床肺科杂志, 2015, 20(3): 456-458.

4 童欣欣, 吕芳丽. 白细胞介素27在寄生原虫感染免疫中的作用研究进展[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2014, 32(3): 234-238.

5 班春梅, 李文倩, 李建平, 等. IL-27抗肿瘤作用机制的研究进展[J]. 细胞与分子免疫学杂志, 2016, 32(3): 410-413.

6 Hu T, Zhao H, Wang K, et al. Association of IL-27 polymorphisms and cancer risk in Chinese population[J]. Recept Signal Transduct Res, 2014, 22(7): 1-4.

7 Di Carlo E, Sorrentino C, Zorzoli A, et al. The antitumor potential of interleukin-27 in prostate cancer[J]. Oncotarget, 2014, 5(21): 10332-10341.

8 Wojno ED, Hosken N, Stumhofer JS, et al. A role for IL-27 in limiting T regulatory cell populations[J]. J Immunol, 2011, 187: 266-273.

9 罗俊华, 吴娜. IL-27、ADA 及INF-γ 在结核性和恶性胸腔积液鉴别诊断中的价值[J]. 河北医药, 2015, 37(4): 512-514.

10 战玉助, 蒋利萍, 王莉, 等. 白细胞介素-27基因多态性与结核病易感性的关系[J]. 第四军医大学学报, 2009, 30(24): 3100-3103.