艾草生物碱提取工艺优化研究

（南阳理工学院生化学院，河南南阳473004）

艾草（Artemisia argyi），又名香艾、艾蒿，为菊科蒿属多年生草本植物，广泛分布于北半球的温带地区，少数分布于非洲、中美洲及南亚等热带地区，在我国主要分布于湖北、湖南、河南、安徽、山东、河北等地[1-2]。其茎、叶有独特香味[3]，药食兼用[4]，经加工可制成具有保健功效和药用价值的功能食品[5-8]。艾草中主要含有精油、生物碱、多糖、黄酮等生物活性成分[9-11]。其中的生物碱类化合物是一种重要的中草药有效成分，有显著的抗肿瘤、抗菌、抗过敏、抗心律失常、抗炎症等药理活性，具有重要的药用价值[12-17]。

艾草生物碱的提取具有影响因素较多、高度非线性的特征。BP神经网络具有强有力的非线性处理能力，可有效表明具有非线性关系的输入量与输出量的关联性，但在实际应用中存在网络全局搜索能力不足、易陷入局部最优等缺陷[18-20]。遗传算法是借鉴生物界自然选择和群体进化机制形成一种全局寻优算法，能优化BP神经网络的连接权值，可很好地克服BP神经网络陷入局部最优的缺陷，求出形式未知函数的最优解[21-23]。

在单因素试验及析因试验的基础上，确定对艾草生物碱得率影响显著的因素，采用Box-Behnken试验设计对影响显著的因素进行优化，利用BP神经网络结合遗传算法对Box-Behnken试验的数据进行建模，通过仿真训练后自寻优，确定最优的艾草生物碱提取工艺参数，以期为艾草生物碱的提取及生理活性研究提供依据。

1 材料

1.1 原料

艾草：南阳市张仲景大药房，粉碎，过筛，备用。

1.2 试剂

盐酸小檗碱标准品：中国药品生物制品检定所；盐酸、硫酸、乙醇（分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；氢氧化钠（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.3 主要仪器设备

BS-210S电子天平：北京塞多利斯天平有限公司；101A-2电热鼓风干燥箱：上海中光仪器仪表有限公司；HHS-6电热恒温水浴锅：上海跃进医疗器械厂；SHB-III循环水式多用真空泵：郑州杜甫仪器厂；SHA-C恒温振荡器：常州国华电器有限公司；UV-l100可见光分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；RE-52旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂。

2 方法

2.1 艾草生物碱提取流程

艾草→粉碎→过筛→浸提→离心→过滤→低温风干→艾草生物碱粗品

2.2 艾草生物碱的检测

艾草生物碱属喹啉类化合物，在350 nm处有稳定吸收峰，检测时可先利用盐酸小檗碱作为对照品绘制标准曲线，提取液经离心后取上清液测其在350 nm波长下的吸光值，与标准曲线进行对照，确定提取液中生物碱的浓度，进而计算生物碱得率[14]。

2.3 盐酸小檗碱标准曲线的绘制

精密称取102℃干燥至恒重的盐酸小檗碱对照品2.81 mg，于50 mL容量瓶中以蒸馏水摇匀定容，得浓度为0.0562 mg/mL的盐酸小檗碱对照品溶液。分别吸取盐酸小檗碱对照品溶液 0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0、2.4、2.8、3.2、3.6 mL 于 10 mL 量瓶中，以 0.05 mol/L 的硫酸定容，350 nm测吸光度值，以盐酸小檗碱浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线[24]。

2.4 单因素试验

分别称取2.0 g经预处理的艾草原料，根据影响艾草生物碱得率的因素，选择料液比、乙醇浓度、提取温度、提取时间等因素作为考查因素，单因素试验时，每次固定其中3个因素，考查另一因素对艾草生物碱得率的影响。

2.5 析因试验设计

在单因素试验的基础上，通过Plaekett-Burman试验设计筛选对艾草生物碱得率影响显著的因素。Plaekett-Burman试验设计的因素水平如表1所示。

表1 Plaekett-Burman试验设计的因素水平表Table 1 Factor and level of Plaekett-Burman experiment design

2.6 Box-Behnken试验设计

由析因试验结果可知提取温度对艾草生物碱得率影响不显著，故确定提取温度为65℃，选取料液比、乙醇浓度、提取时间为自变量，以艾草生物碱得率为响应值，采用Box-Behnken试验设计，进行三因素三水平的Box-Behnken试验设计，因素水平表如表2所示。

表2 Box-Behnken试验设计的因素水平表Table 2 Factor and level of Box-Behnken experiment design

2.7 BP神经网络模型建立

以Box-Behnken试验结果中艾草生物碱得率的数据作为BP神经网络的学习样本，根据Box-Behnken试验的因素数和待优化的指标数设计神经网络的拓扑结构，选择收敛精度10-4，建立BP神经网络[25-26]。

2.8 遗传算法优化

利用遗传算法对BP神经网络模型进行全局寻优，以神经网络的输出值作为求解的目标函数值，以Box-Behnken试验设计的数据作为初始种群，种群规模15，交叉概率0.1，变异概率0.1[27-28]。

2.9 艾草生物碱得率的计算

其中：Y为艾草生物碱得率，mg/g；a为提取液吸光度；v为提取液体积，mL；m为原料质量，g。

3 结果与分析

3.1 盐酸小檗碱标准曲线的绘制结果

盐酸小檗碱标准曲线的绘制结果见图1。

图1 盐酸小檗碱标准曲线Fig.1 The standard curve of berberine hydrochloride

以盐酸小檗碱浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程y=0.0653x+0.0856，R2=0.998（n=10）。

3.2 单因素试验结果

3.2.1 料液比对艾草生物碱得率的影响

料液比对艾草生物碱得率的影响见图2。

图2 料液比对艾草生物碱得率的影响Fig.2 The effect of solid-liquid ratio on yield of Artemisia argyi alkaloids

由图2可知，随着料液比的增大，生物碱得率逐渐升高，当料液比大于1∶40（g/mL）时，随料液比的增大，生物碱得率增加缓慢。可能是料液比达到一定比例时，提取体系处于动态平衡，再增大料液比生物碱得率增加不明显。

3.2.2 乙醇浓度对艾草生物碱得率的影响

乙醇浓度对艾草生物碱得率的影响见图3。

由图3可知，当乙醇浓度小于70%时，随乙醇浓度的增加，艾草生物碱得率逐渐增大，乙醇浓度大于70%，随乙醇浓度增加，艾草生物碱得率呈下降趋势。

图3 乙醇浓度对艾草生物碱得率的影响Fig.3 The effect of ethanol concentration on yield of Artemisia argyi alkaloids

3.2.3 提取温度对艾草生物碱得率的影响

提取温度对艾草生物碱得率的影响见图4。

图4 提取温度对艾草生物碱得率的影响Fig.4 The effect of extraction temperature on yield of Artemisia argyi alkaloids

由图4可知，在65℃～75℃，随着提取温度升高，艾草生物碱的得率逐渐增加，当温度超过75℃，艾草生物碱的得率呈下降趋势，可能是温度过高使生物碱部分降解或异构化，导致得率降低。

3.2.4 提取时间对艾草生物碱得率的影响

提取时间对艾草生物碱得率的影响见图5。

图5 提取时间对艾草生物碱得率的影响Fig.5 The effect of extraction time on yield of Artemisia argyi alkaloids

由图5可知，随提取时间的增加，艾草生物碱得率逐渐提高，提取时间大于100 min时，随提取时间的延长，生物碱得率趋于稳定。这可能达到一定提取时间，生物碱已充分溶出，再增大提取时间对生物碱得率影响不大。

3.3 析因试验及结果

析因试验试验结果见表3，方差分析结果见表4。

表3 析因试验结果Table 3 The results of factorial experiment

表4 方差分析表Table 4 The analysis of variance table

从方差分析表中可以看出，料液比、乙醇浓度和提取时间为显著性因子，提取温度对艾草生物碱的影响不显著，故选择料液比、乙醇浓度和提取时间作为响应面分析试验的考察因素，以确定这些因素的最优水平。根据效应分析的原则，选择提取温度为65℃进行Box-Behnken试验。

3.4 BP神经网络模型建立

Box-Behnken试验结果见表5。

表5 Box-Behnken试验结果Table 5 The results of Box-Behnken experiment

根据Box-Behnken试验的结果，采用BP神经网络建立Box-Behnken试验的数学模型，BP神经网络的学习及训练过程如图6所示。

图6 BP神经网络训练过程Fig.6 The training process of BP neural network

由图6知，随训练次数增多，BP神经网络的训练误差平方和逐渐减小，经15512次训练，神经网络收敛，收敛精度达10-4。

3.5 遗传算法优化结果

遗传算法寻优过程见图7。

经过200代遗传进化，遗传算法预测的最佳参数为：料液比1∶46.5830（g/mL），乙醇浓度50.0065%，提取时间85.2250 min；艾草生物碱得率为0.3859 mg/g。为便于实际操作，将遗传算法预测的最佳工艺参数修正为：料液比1∶47（g/mL），乙醇浓度 50%，提取时间85 min。

图7 遗传算法寻优过程Fig.7 The optimizing computation process of genetic algorithm

3.6 最优提取工艺的验证试验

根据单因素及析因试验结果，并与遗传算法理论预测修正后的提取条件相结合，确定艾草生物碱最优提取工艺参数为：料液比1∶47（g/mL），乙醇浓度50%，提取时间85 min，提取温度65℃，根据此条件进行3次验证试验取平均值，结果为0.3827 mg/g。

4 结论

1）利用Box-Behnken试验中的因素水平及待优化的试验指标数设计BP神经网络的结构，利用Box-Behnken试验数据，采用BP神经网络建立料液比、乙醇浓度、提取时间与艾草生物碱得率之间关系的数学模型，经15512次学习训练，神经网络模型收敛，收敛精度达10-4，说明所建立的神经网络模型逼近能力较强，可将此模型应用于这3个提取工艺参数的优化。

2）结合单因素、析因试验结果，并与遗传算法预测修正后的提取参数相结合，得到艾草生物碱最优的提取工艺参数为：料液比1∶47（g/mL），乙醇浓度50%，提取时间85 min，提取温度65℃。在此条件下，艾草生物碱得率可达0.3827 mg/g。

3）采用BP神经网络和遗传算法结合对艾草生物碱的提取工艺参数进行优化可靠性较高，能够为进一步的试验研究提供依据。

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