Th17/Treg细胞及IL-17与不明原因复发性流产关系的研究

罗 娜，林 彤，范立青,中南大学基础医学院 生殖与干细胞工程研究所，湖南长沙 400；深圳市龙华区妇幼保健院 妇产科，广东深圳 58000；中信湘雅生殖与遗传专科医院，湖南长沙 400

复发性流产(recurrent spontaneous abortion，RSA)是指2次或2次以上发生于妊娠20周之前的妊娠胚胎丢失，其发病可能的因素包括遗传因素、内膜因素、胎盘因素、解剖因素、免疫因素、生殖道感染以及环境因素等[1]。此外临床上仍有40% ～ 50%的患者流产原因不明，称为不明原因复发性流产(unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA)。近期研究发现，辅助性T细胞17(T helper cells 17，Th17)/调节性T细胞(T regulatory cell，Treg)失衡导致Th17偏移[2-3]，白细胞介素-17(interleukin-17，IL-17)升高引起的母胎界面细胞因子网络改变与URSA有关[4-5]。本研究通过观察URSA患者外周血中Th17和Treg细胞含量及IL-17水平变化，探讨免疫平衡失调在URSA发病机制中的作用，为临床防治提供依据。

对象和方法

1 一般资料 选取2015年1月- 2017年10月中南大学湘雅医院收治的URSA患者162例(URSA组 )，年龄 21 ～ 43(34.12±4.18)岁，孕周 53 ～ 76(66.80±5.20) d。纳入标准：1)复发性流产发生于同一妊娠月份，临床表现与一般流产相同；2)有停经史，有或无阴道流血，伴或不伴腹痛；3)B超检查证实胚胎停止发育，需行人工流产；4)停经后若阴道流出鲜肉样组织，常规组织病理检查为宫内绒毛组织；5)双方染色体核型分析正常，男方精液分析正常。排除标准：1)近期合并病毒感染；2)合并内分泌系统疾病、自身免疫性疾病、女性激素异常及有生殖系统畸形。另选取同期正常早孕要求行人流的女性90例为对照组、孕龄期体检正常且未孕女性90例为未孕组，既往均至少1次正常分娩史，无不良生育史及慢性疾病，无家族遗传病史。本研究经医院伦理委员会批准，并签署知情同意书。

2 主要仪器及试剂 流式细胞仪为美国Becton Dickinson公司的FACS Calibur，流式细胞仪采用的流式抗体均购自美国Becton Dickinson公司产品。细胞刺激培养所需离子霉素、豆蔻酰佛波醇乙酯、莫能菌素购自美国ENZO Alexis-Biomol公司，胞内检测所需固定破膜试剂盒及荧光定量PCR所需试剂购自美国Invitrogen公司，所需引物、探针由上海博亚生物技术公司合成。荧光定量PCR仪购自美国Applied Biosystems公司(ABI 7500 Sequence Detection System)，酶标仪购自美国Bio-Rad公司(型号550)，低温高速离心机(Beckman)。

3 检测方法 所有研究对象均于清晨空腹采集静脉血3 ml，经肝素抗凝及加入等体积淋巴细胞分离液后，1 500 r/min离心15 min，得到外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)悬液，铺至24孔细胞培养板，并在RPMI-1640培养基中加入10% FCS(胎牛血清)。每孔加入豆蔻酰佛波醇乙酯2.5μl(终浓度50 ng/ml)、离子霉素2μl(终浓度1μg/ml)及莫能菌素2μl(终浓度10μg/ml)吹打混匀，孵育4 h。加入抗人CD4单抗20μl，室温避光孵育20 min。再通过加入染色缓冲液2 ml及抗IL-17单抗20μl，室温孵育15 min，此后1 500 r/min离心10 min，弃上清，加入染色固定液1 ml，等待上流式细胞仪检测Th17、Treg细胞含量。采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清IL-17水平，试剂盒购自上海源叶生物科技有限公司，操作过程严格按照说明书进行。

4 统计学分析 采用SPSS20.0统计软件分析，计量资料以-x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验；两组间比较采用t检验。相关性分析采用Pearson相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 各组一般资料的比较 URSA组、早孕组及未孕组的年龄、体质量指数、月经周期、妊娠囊大小差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

2 各组Th17、Treg、Th17/Treg及IL-17水平比较

表1 各组一般资料比较Tab. 1 Comparison of general data between groups

表2 各组Th17、Treg、Th17/Treg及IL-17水平比较Tab. 2 Comparison of Th17, Treg, Th17/Treg and IL-17 levels between groups

图 1 未孕组、早孕组和URSA组Th17及Treg细胞比例 A：未孕组； B：早孕组； C：URSA组Fig. 1 Proportion of Th17 and Treg cells of unpregnant, early pregnant and URSA groups A: pregnant group; B: early pregnancy group; C: URSA group

URSA组Th17、Th17/Treg及IL-17水平明显高于未孕组和早孕组(P均＜0.01)；URSA组Treg细胞含量明显低于未孕组和早孕组(P＜0.01)。早孕组和未孕组Th17、Treg、Th17/Treg及IL-17水平差异无统计学意义(P均＞0.05)。见图1、表2。3 URSA患者Th17/Treg与IL-17的相关性分析Pearson相关分析显示，URSA患者Th17/Treg与IL-17呈正相关(r=0.805，P＜0.01)。见图2。

图 2 URSA患者Th17/Treg与IL-17的相关性Fig. 2 Correlation between Th17/Treg and IL-17 in URSA patients

讨 论

URSA是临床上常见的异常妊娠，严重危害女性生殖健康。URSA病因及病理机制复杂，大多学者认为，其与母胎界面发生的免疫耐受机制异常有关[6-7]。目前母胎界面免疫耐受机制主要包括人类白细胞抗原的调节异常，自然杀伤细胞、T淋巴细胞、巨噬细胞和树突状细胞等免疫细胞的功能异常，细胞凋亡，以及补体系统、趋化因子表达异常等[8]。近年来，Treg细胞及Th17细胞在母胎界面免疫耐受中所起的作用已成为热点问题。Th17是新发现的一种具有促炎作用的Th细胞亚群，具有很强的促炎作用，其与免疫性疾病及急性排斥反应的发生发展密切相关[9]。Treg是一类特异性表达转录因子FOXP3，具有免疫负性调节功能的CD4+细胞，可通过细胞间接触抑制及分泌抑制性细胞因子等途径发挥抗炎和维持自身免疫耐受的作用。Treg所介导的免疫抑制在母体免疫耐受中起关键作用，Treg在数量和功能上的缺陷可能导致URSA，对母体免疫耐受的维持有重要意义[10]。IL-17是Th17细胞的主要效应因子，具有促炎症作用，能够诱导促炎性细胞因子、趋化因子和基质金属蛋白酶的表达，诱导中性粒细胞的活化与聚集，引起组织细胞浸润和组织破坏等[11]。

本研究结果显示，URSA组Th17、Th17/Treg及IL-17水平明显高于未孕组和早孕组，URSA组Treg细胞含量明显低于未孕组和早孕组，而早孕组和未孕组Th17、Treg、Th17/Treg及IL-17水平差异无统计学意义。说明在URSA的发病过程中，具有免疫抑制作用的Treg细胞减少，同时具有促炎作用的Th17细胞及IL-17水平上升，引起免疫平衡失调，导致母体免疫系统对胚胎发生排斥反应，影响胚胎着床及发育，从而导致了流产的发生。有研究表明，在正常妊娠早期，CD4+CD25+Treg细胞比例明显增高，而URSA患者外周血中Treg细胞比例则显著降低，提示Treg细胞参与抑制母体对胎儿的同种异体排斥反应，在维持正常妊娠免疫耐受中发挥重要作用；URSA患者外周血Th17细胞比例明显高于正常早孕妇女，说明Th17细胞水平升高不利于妊娠的维持[12]。Sereshki等[13]研究发现，生理水平的Th17细胞具有显著促进胚胎成功着床的作用，Treg细胞抑制Th17的炎症作用，Th17/Treg细胞比例失衡可发生胚胎排斥，进而导致着床失败和反复自然流产。Winger和Reed[14]通过对55名有流产或不孕史妊娠妇女早孕期外周血Treg含量进行分析，发现Treg比例低的患者继续维持妊娠的概率低于比例高者，由此推测Treg可作为评估早孕期妇女流产危险性的标志，有望成为预测妊娠结局新指标。Wu等[15]通过淋巴细胞免疫治疗后，可以使URSA患者外周血中的Treg细胞增加，而Th17细胞减少，诱导Treg细胞及其他介导免疫耐受的细胞发挥免疫耐受作用，从而改善患者体内免疫微环境，有利于维持妊娠。Lee等[16]研究发现，URSA患者血清IL-17水平明显高于正常妊娠妇女，提示IL-17可能通过诱导中性粒细胞及炎性因子在母胎界面的聚集而导致流产的发生。

Saifi等[17]对有复发性流产病史和既往正常妊娠的群体研究发现，既往有复发性流产病史患者黄体期外周血中Th17、IL-17水平明显高于既往正常妊娠者。相关分析显示，URSA患者Th17/Treg与IL-17呈正相关，进一步提示IL-17可能与Th17/Treg等免疫细胞存在关联，共同参与URSA发病过程。亦有研究认为，妊娠期母体对胎儿的免疫耐受是由Th17、Treg及IL-17共同调控，任何一方的异常均会引起体内免疫功能失衡，进而导致URSA发生[18]。

综上所述，在URSA患者外周血中，Treg细胞水平明显下降而Th17、Th17/Treg及IL-17显著升高，其可能参与了URSA的发生发展过程。但Th17/Treg及IL-17在URSA发病机制中的具体作用尚需更多基础性研究来进一步证实。

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