PI3K/AKT信号通路在大鼠腹腔感染性脓毒症急性肾损伤中的作用

杨蕊，许华，王兵，王勇强△

脓毒症是机体对感染的反应失调而导致的危及生命的器官功能障碍，是重症监护病房（ICU）患者死亡的首要因素［1］。其中肾脏是最常受累的器官之一，急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）常常是预测脓毒症患者死亡的独立危险因素。白细胞介素（IL）-1β及IL-18作为炎症形成早期的主要促炎因子［2］，其释放受半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶1（Caspase-1）的调控，而后者又与Nod样受体蛋白3（NLRP3）炎性小体密切相关［3］。作为一种蛋白复合物，NLRP3炎性小体包括NLRP3、Caspase-1和凋亡相关斑点样蛋白（ASC）。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）通路在炎症反应过程中也发挥重要作用，其活化后可诱导NLRP3炎性小体表达升高［4］。本研究通过盲肠结扎穿孔法（cecal ligation and puncture，CLP）复制大鼠腹腔感染性脓毒症模型，并通过检测相关指标确认AKI的发生，进而探讨PI3K/AKT通路及NLRP3炎性体激活在大鼠腹腔感染性脓毒症相关AKI发病中的作用，为防治脓毒症AKI提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及分组 清洁级雄性SD大鼠70只，8～10周龄，体质量220～250 g，购于解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所动物实验中心，所有大鼠均在同一实验室按照清洁级要求适应性饲养1周，室温（20±1）℃，湿度（60±10）%，每日光照12 h。所有大鼠采用随机数字表法分为假手术组（n=10）、CLP 24 h组（n=20）、CLP 48 h组（n=20）、CLP 72 h组（n=20）。

1.1.2 主要试剂及仪器 ABI-7500 Real-time PCR检测仪购自美国ABI公司；多功能酶标仪购自美国BioTek公司；EPS300电泳仪购自美国Bio-Rad公司；FluorChemFC2型显影仪购自美国Alpha Innotech公司；Real-time PCR试剂盒购自美国CWbio公司；兔抗大鼠NLRP3多克隆抗体、山羊抗大鼠ASC多克隆抗体、兔抗大鼠Caspase-1单克隆抗体购自美国Abcam公司，小鼠抗大鼠β-actin单克隆抗体购自美国abbkine公司；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IL-1β及IL-18酶联免疫吸附法（ELISA）检测试剂盒购自美国RayBiotech公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体、兔抗山羊抗体、兔抗小鼠抗体购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 模型制备 根据Rittirsch等［5］报道的方法建立CLP诱导的大鼠腹腔感染性脓毒症模型。所有动物造模均在上午8:00—10:00进行，术前禁食不禁水，用5%水合氯醛溶液（6 mL/kg）对大鼠腹腔注射进行麻醉，腹正中切口切开1 cm，识别盲肠并将其拉出，在盲肠总长度50%处进行结扎，用18号针头在结扎线下5 mm处进行穿刺后将盲肠放回腹腔并关腹。假手术组操作与CLP组相同，但不进行盲肠结扎及穿孔。分别观察假手术组和CLP各组大鼠的外观形态、活动、饮食等情况。假手术组大鼠全部存活，CLP 24 h组死亡7只，CLP 48 h组死亡11只，CLP 72 h组死亡13只。

1.2.2 样本采集 在术后24、48、72 h对CLP各组及假手术组的存活大鼠进行腹主动脉取血，以2 000 r/min离心15 min后留取血清备用。大鼠处死后摘取肾脏组织，剪碎后冻存于-80℃备用。

1.2.3 肾脏功能检测 在术后24、48、72 h取血应用全自动生化分析仪检测血肌酐（Cr）和尿素氮（BUN）水平。

1.2.4 肾脏组织PI3K/AKT mRNA表达水平检测 取50～100 mg冷冻肾脏组织，按照试剂盒说明书先提取总RNA，之后逆转录合成cDNA。所有产物作为Real-time PCR的模板。根据NCBI基因库查询到的基因mRNA序列，用Primer-BLAST设计引物（表1），进行扩增，以GAPDH作为内参，用ABI 7500 Real-time PCR System进行检测，采集荧光信号制作融解曲线，所得Ct值用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。

Tab.1 Real-time PCR primer sequences of PI3K/AKT表1 PI3K/AKT Real-time PCR引物序列

1.2.5 肾脏组织NLRP3炎性小体蛋白表达水平检测 应用蛋白质免疫印迹法（Western blot，WB）测定肾脏组织蛋白表达水平。组织冰上匀浆并裂解蛋白，4℃、12 000 r/min离心15 min，取上清，BCA蛋白定量，取20 μL蛋白样品进行电泳、转膜、封闭并孵育一抗4℃过夜；次日TBST洗膜后将膜与辣根过氧化酶标记的抗IgG抗体孵育，室温摇床上轻摇2 h，再用TBST洗膜，加显影液显影。采用Bio-Rad图像分析系统分析条带灰度值，以β-actin为内参，计算目的蛋白与内参蛋白灰度值比值得到目的蛋白相对表达量。

1.2.6 血清IL-1β、TNF-α及IL-18水平检测 严格按照ELISA试剂盒说明书检测血清IL-1β、TNF-α及IL-18水平。

1.3 统计学方法 使用SPSS 22.0统计软件对数据进行统计与分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），组间多重比较采用SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肾脏组织一般情况及功能指标 腹腔解剖可见，CLP各组大鼠肾脏组织呈暗红色，可见明显充血及肿胀。假手术组血Cr及BUN水平较低且平稳，与假手术组相比，CLP各组Cr及BUN水平明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。表明脓毒症AKI模型制备成功。

Tab.2 Changes of serum levels of creatinine and blood urea nitrogen in four groups表2 各组大鼠血Cr及BUN变化 （±s）

Tab.2 Changes of serum levels of creatinine and blood urea nitrogen in four groups表2 各组大鼠血Cr及BUN变化 （±s）

＊＊P＜0.01；a与假手术组比较，b与CLP24 h比较，c与CLP48 h比较，P＜0.05；表3～5同

n组别假手术组CLP 24 h组CLP 48 h组CLP 72 h组F 10 13 9 7 Cr（μmol/L）45.79±7.63 79.40±5.96a 80.42±8.87a 82.88±9.78a 66.249＊＊BUN（mmol/L）7.78±1.53 18.35±2.21a 20.97±2.05ab 24.53±1.79abc 115.448＊＊

2.2 各组大鼠肾脏组织PI3K、AKT mRNA表达水平 假手术组大鼠肾脏组织PI3K、AKT mRNA的表达水平较低；与假手术组相比，CLP各组PI3K、AKT的mRNA表达水平明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表3。

Tab.3 The expression levels of PI3K and AKT mRNA in kidney tissues in four groups表3 各组大鼠肾脏组织中PI3K、AKT的mRNA表达水平（±s）

Tab.3 The expression levels of PI3K and AKT mRNA in kidney tissues in four groups表3 各组大鼠肾脏组织中PI3K、AKT的mRNA表达水平（±s）

n组别假手术组CLP 24 h组CLP 48 h组CLP 72 h组F 10 13 9 7 PI3K 1.19±0.03 1.54±0.31a 2.26±0.52ab 3.38±0.37abc 63.331＊＊AKT 1.02±0.17 1.46±0.24a2.38±0.19ab 3.21±0.27abc 166.134＊＊

2.3 各组大鼠肾脏组织NLRP3炎性小体蛋白表达水平 与假手术组相比，CLP各组的NLRP3、ASC及Caspase-1的表达水平均显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05），见表4、图1。

Tab.4 The expression levels of NLRP3/ASC/Caspase-1 in kidney tissues in four groups表4 各组大鼠肾脏组织中NLRP3/ASC/Caspase-1的蛋白表达水平 （%，±s）

Tab.4 The expression levels of NLRP3/ASC/Caspase-1 in kidney tissues in four groups表4 各组大鼠肾脏组织中NLRP3/ASC/Caspase-1的蛋白表达水平 （%，±s）

n组别假手术组CLP 24 h组CLP 48 h组CLP 72 h组F 10 13 9 7 NLRP3 10±4 72±3a 71±4a 79±6abc 633.397＊＊ASC 2±1 88±3a 94±6a 95±3ab 1 231.863＊＊Caspase-1 8±3 76±2a 78±1ab 82±6ab 992.553＊＊

2.4 各组大鼠血清炎症因子表达水平 与假手术组相比，CLP各组的血清TNF-α、IL-1β及IL-18水平均显著升高（P＜0.01）。其中CLP 48、72 h组IL-1β水平较24 h组升高，而IL-18水平则出现下降（P＜0.01），见表5。

Fig.1 The expression levels of NLRP3/ASC/caspase-1 in kidney tissues of each group图1 各组大鼠肾脏组织中NLRP3/ASC/caspase-1的蛋白表达水平

Tab.5 The serum expression levels of TNF-α,IL-1β and IL-18 in four groups表5 各组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-18的表达水平（ng/L，±s）

Tab.5 The serum expression levels of TNF-α,IL-1β and IL-18 in four groups表5 各组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-18的表达水平（ng/L，±s）

n组别假手术组CLP 24 h组CLP 48 h组CLP 72 h组F 10 13 9 7 TNF-α 33.76±3.46 346.86±10.97a 339.55±13.32a 349.68±6.17ac 2 834.366＊＊IL-1β 35.39±4.62 88.42±11.07a 105.45±8.61ab 104.01±10.21ab 117.445＊＊IL-18 33.67±8.14 254.33±18.52a 207.67±14.18ab 164.03±9.08abc 483.999＊＊

3 讨论

据世界卫生组织不完全统计，发达国家脓毒症发病率以每年8%～13%的速度急剧增加，且住院患者的病死率高达30%～60%，而高龄患者的病死率达50%以上［6］。脓毒症以严重的炎症反应为特征，而失控性炎症反应是导致多器官功能障碍综合征的主要因素之一。肾脏是炎症因子首要攻击的靶器官之一［7］，其内皮细胞被激活后会产生炎症因子。传统意义上认为肾脏损伤是血流动力学改变导致的肾脏缺血［8］，但近年来的研究认为，脓毒症AKI的发生主要与应激激素、炎性介质、内毒素、内皮素、血管内皮与一氧化氮合酶、活性氧簇等有关［9］。本实验通过检测与大鼠肾脏功能相关的指标Cr、BUN，证实腹腔感染性脓毒症造成了AKI，进而对肾脏组织内的PI3K/AKT信号通路及NLRP3炎性小体进行检测，明确其在脓毒症AKI发生发展中的作用。

机体在缺氧、感染或饥饿时利用溶酶体降解自身受损的细胞器和大分子物质，为细胞修复及更新提供原料与营养，保持能量稳态，而PI3K/AKT是影响这个过程的重要信号通路。PI3K属于脂质激酶家族，能使肌醇环第3位羟基磷酸化为磷脂酰肌醇激酶。AKT是丝氨酸/苏氨酸激酶，可调节细胞周期、增殖、凋亡等活动。PI3K/AKT通路活化后可激活固有免疫系统，而模式识别受体是固有免疫系统激活的必备条件［10］。NLRP3炎性小体作为胞浆内的一种模式识别受体，主要是由NLRP3、衔接蛋白ASC及Caspase-1三部分组成的蛋白复合物［11］。研究表明在炎症反应中抑制PI3K/AKT通路后NLRP3的表达降低，IL-1β释放量显著减少［12］。本次研究亦证实，与假手术组相比，CLP各组大鼠肾脏组织PI3K、AKT的mRNA的表达水平明显升高，CLP各组大鼠肾脏组织NLRP3、ASC及Caspase-1的表达水平也显著升高，表明在脓毒症AKI时PI3K/AKT活化并激活其下游的NLRP3炎性小体，使其释放量明显增加，从而加重机体的炎症反应。

在脓毒症中TNF-α、IL-1β和IL-18是具有诊断和预测价值的炎症因子［13］。IL-18属于IL-1家族的促炎症因子，主要由巨噬细胞释放并诱导干扰素（IFN）-γ，IFN-γ通过合成NO发挥抗菌和抗病毒作用［14］。Vanden Berqhe等［10］利用IL-1β/IL-18基因敲除的小鼠建立CLP脓毒症模型，发现同时缺乏IL-1β和IL-18的小鼠由于自身具有保护性而不表现出脓毒症症状。本研究显示，与假手术组相比，CLP各组的IL-1β、TNF-α及IL-18水平均显著升高（P＜0.01），考虑脓毒症AKI时有大量的炎性介质释放，其中IL-1β和IL-18水平的迅速升高可能与炎性小体活化有关。但本次研究未检测脓毒症AKI早期的细胞因子水平及炎性小体释放量的变化。

综上所述，在大鼠腹腔感染性脓毒症AKI模型中PI3K/AKT通路介导NLRP3炎性小体表达增加，进而使其下游炎症因子释放增加而加重脓毒症AKI症状，提示PI3K/AKT在一定程度上参与脓毒症AKI病情的进展，IL-1β、IL-18可在一定意义上提示脓毒症AKI病情的严重程度，但其具体作用机制仍需进一步研究。

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