清脑通络方对老年性阿尔茨海默病大鼠海马突触结构的重建作用

程骁 ，邓敏贞 ，侯紫君 ，华荣 ，孙景波

1.广东省中医院脑病中心，广东 广州 510120

2.广东省中医药科学院，广东 广州 510006

3.河南南阳理工学院，河南 南阳 473004

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)，又称老年性痴呆，是一种发生于中老年的原发性脑退行性疾病，其患病率随着社会的老龄化而增加，已成为严重的社会问题。虽然AD的病理机制至今仍不清楚，但基底前脑胆碱能神经元丢失、海马区突触大量丧失是AD的主要病理改变[1]。海马是脑处理学习记忆功能的重要结构，这一功能与海马突触可塑性关系密切。成熟的神经系统虽然不再产生新的神经元，并且神经元胞体一直保持相对稳定的状态，但神经元却具有产生新的突起和形成新的突触连接的能力，同时神经元的突起包括轴突末梢、树突及树突侧棘等一直处于可修饰状态，这种能力是神经环路可塑性的基础[2]。清脑通络方对AD模型大鼠的学习记忆行为有明显的改善作用[3]，为了观察该方的作用机理，本实验探讨该方对AD模型大鼠海马突触结构的影响。

1 材料与方法

1.1 动物与分组 健康雄性Wistar大鼠，3月龄15只，体质量200～250 g，为青年组。20月龄60只，体质量450～550 g，随机抽取15只用作为老年组，其余45只大鼠为造模组。所有大鼠均由广州中医药大学实验动物中心提供，合格证编号为26-2005A001，实验在广东省中医药科学院动物实验中心SPF级动物实验室进行，使用许可证号：SYXK(粤)2013-0094。

1.2 仪器和试剂 D-半乳糖(上海试剂二厂)；鹅膏蕈氨酸(美国Sigma公司)；动物脑立体定位仪(美国Stoling公司)；清脑通络方(决明子、丹参、山楂、赤芍、川芎、水蛭等用水提醇工艺制成2 g/mL药液，4℃保存)；石杉碱甲(临用前配制成6 mg/100mL液体)。

1.3 模型制备与干预 动物适应性喂养2周，造模组45只大鼠腹腔注射0.96%D-半乳糖(生理盐水配制)，5mL/(kg·d)，连续6周。青年组和老年组大鼠腹腔注射生理盐水，5mL/(kg·d)，连续6周。从第7周开始，造模组大鼠双侧基底前脑注射鹅膏蕈氨酸，以3%戊巴比妥钠35mg/kg的剂量腹腔注射麻醉大鼠，将大鼠固定于脑立体定位仪上，纵向切开头皮，暴露颅骨，参照paxins和watson大鼠脑立体定位图谱(Academic Press，1982)[4]，梅纳特基底核(Meynert基底核)坐标为AP-0.8 mm，Lat 2.6 mm，DV-8.2 mm(前囟后0.8 mm，中线旁开2.6mm，颅骨下8.2mm)，每侧缓慢注射鹅膏蕈氨酸1μL(生理盐水配制，浓度 5μg/μL)，注射时间每侧 10 min，留针10 min。青年组和老年组在相同脑区注射等体积的生理盐水。2周后，将造模组存活的大鼠随机分为模型组、清脑通络方组和石杉碱甲组，每组10只。清脑通络方组以清脑通络方灌胃，5mL/(kg·d)，相当于生药量6 g/(kg·d)；石杉碱甲组以石杉碱甲灌胃，5mL/(kg·d)，相当于生药量0.3mg/(kg·d)；模型组、青年组和老年组以等体积的生理盐水灌胃，连续4周。

1.4 标本制备与观察 取每组大鼠各3只，以含0.2%戊二醛、4%多聚甲醛的磷酸缓冲液经心灌注固定，取脑，置同样固定液后固定4 h。各标本均取海马CA1区和CA3区同一部位组织，组织块大小约1mm3，每一部位取组织块4～6个。用0.01mol/LPBS洗组织块3次，每次15min，1%锇酸固定1 h后(4℃)，再用0.01mol/LPBS洗3次，每次15min。梯度酒精脱水，用50%，70%酒精各5min，80%，90%，95%，99%酒精各10min，再用100%酒精脱水2次，每次10min，用丙酮脱水2次，每次10min。用丙酮∶包埋剂＝1∶1，渗透1 h；丙酮∶包埋剂＝1∶3，渗透2 h，纯包埋剂共渗透3 h。将渗透后的组织块放在盛有苯二甲酸二丙烯酯包埋剂(包埋剂配方：苯二甲酸二丙烯酯10mL、邻苯二甲酸二丁酯2mL、过氧化苯甲酰0.4～0.6 g)的胶囊内，置60℃烤箱，聚合48 h。超薄切片：片厚600A，230目铜网捞片，醋酸铀和枸橼酸铅双染。

电镜观察与拍照：每只大鼠每一部位观察3个铜网，每张铜网由左上角至右下角斜线上移动，随机拍摄照片5张，共15张。突触放大倍数2万倍，拍照，最终放大倍数4万倍。

1.5 突触形态参数的定量分析 用体视学方法分析海马CA1区和CA3区突触数密度(Nv)、突触连接带面密度(Sv)和突触连接带平均面积(S)。在透明胶片上绘制2mm×2mm的标准测试网格，将该测试网格覆盖于电镜照片上，按Freddari[5]方格点计数法逐一测量每张照片中的突触数量和突触连接带与测试线的交点数，用下列公式计算突触的数密度、面密度和平均面积。

Na是每个平方微米的突触总数，L是突触连接带的平均长度(μ m)，可由公式 L＝ La/Na；La＝ (π /2)× (Ni／ LT)计算得到，T为超薄切片的厚度(600A)，LT为测试线总长度，Ni为突触连接带与测试线的交叉点数，K0＝1＋3T/2L为校正系数，校正因子Holmes'效应引起的对突触连接带长度的过高估计。Sv＝ 2Ni／ LTK0(μm2/μm3)，突触连接带的平均面积 S＝ Sv/Nv。

1.6 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件进行数据处理，计量资料以(±s)表示，组间差异采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 各组大鼠海马区突触特征 见图1。电镜下可见老年组和青年组大鼠海马区神经毡膜性结构，神经元的树突可见到各种断面，断面较平滑、完整。模型组大鼠海马区神经毡膜性结构皱缩，神经元的树突可见断面较少，突触附近空泡化较多。清脑通络方组和石杉碱甲组神经毡膜性结构皱缩缓解，神经元的树突可见断面增多，突触附近空泡化减弱，突触前、突触后神经细胞膜增厚，有些突触后膜增厚更明显，突触前后膜之间有明显的突触间隙，在突触前终末(presynaptic terminal)内可见大量突触小泡和线粒体。

图1 各组大鼠海马区突触特征 (×40 000)

2.2 各组大鼠海马CA1区和CA3区突触数密度（Nv）结果比较 见表1。老年组大鼠CA1区和CA3区突触数密度与青年组比较无明显变化。与老年组比较，模型组大鼠CA1区和CA3区突触数密度显著降低(P＜0.01)。与模型组比较，清脑通络方组和石杉碱甲组大鼠在CA1区和CA3区的突触数密度显著增加(P＜0.05，P＜ 0.01)。

表1 各组大鼠海马CA1区和CA3区突触数密度（Nv）结果比较(±s) 个/μm3

表1 各组大鼠海马CA1区和CA3区突触数密度（Nv）结果比较(±s) 个/μm3

与老年组比较，①P＜0.01；与模型组比较，②P＜0.05，③P＜0.01

组 别青年组老年组模型组清脑通络方组石杉碱甲组n 15 15 10 10 10 CA1 2.743 6±0.489 1 2.708 2±0.567 5 2.091 7±0.456 9①2.447 7± 0.416 8③2.254 1± 0.427 8②CA3 2.712 5±0.512 1 2.677 9±0.436 2 2.181 3± 0.443 2①2.476 3±0.449 3③2.345 7±0.429 6②

2.3 各组大鼠海马CA1区和CA3区突触面密度（Sv）结果比较 见表2。老年组大鼠CA1区和CA3区突触面密度与青年组比较无明显变化。与老年组比较，模型组大鼠CA1区和CA3区突触面密度显著降低(P＜0.01)。与模型组比较，清脑通络方组大鼠在CA1区和CA3区的突触面密度增加(P＜0.01)，石杉碱甲组大鼠在CA3区突触面密度增加(P＜0.01)。与石杉碱甲组比较，清脑通络方组大鼠在CA1区的突触面密度增加(P＜ 0.01)。

2.4 各组大鼠海马CA1区和CA3区突触平均面积（S） 比较见表3。各组大鼠CA1区和CA3区的突触平均面积均无显著差异(P＞ 0.05)。

3 讨论

AD主要由肾精亏虚，脑髓失充，痰瘀互阻，导致脑髓枯萎所致，治疗应化瘀祛痰开窍，补肾填髓[6]。课题组成员在长期临床实践中总结出老年性痴呆存在颅脑水瘀这一病理机制，瘀血与水湿痰浊互阻于脑内为其主要病机，在临床中使用清脑通络方治疗具有颅脑水瘀病理机制的疑难脑病，该方以通窍、化瘀、利水为主，由决明子、丹参、山楂、赤芍、川芎、水蛭等药物组成，在临床上有较好的效果[7]。实验研究亦表明，该方对AD模型大鼠学习记忆功能有较好的改善作用[3]。

表2 各组大鼠海马CA1区和CA3区突触面密度 (Sv)结果比较(x± s) μm2/μm3

表3 各组大鼠海马CA1区和CA3区突触平均面积（S）比较(x± s) μm2

AD患者海马区突触大量丢失，造成学习记忆功能障碍。海马突触长时程增强(LTP)被认为是突触传递可塑性的证据，并已成为研究学习记忆过程的突触模式。大量研究报告对突触多种结构参数进行定量测定，探讨突触传递效能变化与形态结构的相关性，发现了某些传递效能与形态结构的相应改变。学习记忆障碍与脑内神经信息传递的关键结构——突触的可塑性变化有关，如衰老时发生脑内突触密度减低、突触平均面积代偿性增大及LTP减弱[8]等突触可塑性变化。研究显示，补肾益气及活血化瘀方药对老年性AD大鼠海马区神经突触数密度、面密度及突触平均面积的减少均有改善作用[9]。

结果表明，老年组大鼠CA1区和CA3区突触形态与青年组比较无明显变化，突触数密度、突触面密度及突触平均面积与青年组比较均无明显改变，说明单纯生理性衰老对突触没有明显影响。而模型组大鼠CA1区和CA3区突触数密度、突触面密度较青年组和老年组显著下降，说明基底前脑胆碱能神经元损害对海马突触产生了显著影响，造模成功。清脑通络方组大鼠突触数密度和突触面密度无论在CA1区或CA3区均明显高于模型组，说明清脑通络方可减少大鼠海马CA1区和CA3区突触的损伤。石杉碱甲组大鼠在CA1区和CA3区的突触数密度增加，CA3区突触面密度增加，说明石杉碱甲可减少大鼠海马CA3区突触的损伤。清脑通络方组与石杉碱甲组比较，在CA1区，清脑通络方组突触面密度明显高于石杉碱甲组，在CA3区两者未显示出明显差异，说明清脑通络方对模型大鼠海马CA1区和CA3区突触损害有显著的保护作用，其保护范围比石杉碱甲广，保护作用跟石杉碱甲相近。此外，清脑通络方组突触面密度在CA1区已经恢复到老年组水平，在CA3区还未恢复到老年组水平；其突触数密度较模型组有明显增高，但仍未恢复到老年组水平，这说明清脑通络方的主要保护作用是增加海马CA1区突触面密度。

综上所述，清脑通络方对老年性AD大鼠海马突触有显著的改善作用，主要体现于减缓模型大鼠海马CA1区和CA3区突触损害和增加海马CA1区突触面密度这两个方面。

[1] 李常琼．早期APP/PS1转基因AD模型小鼠海马胆碱能神经元改变的体视学研究[D]．重庆：重庆医科大学，2017.

[2] 张雪玲，王黎明，陈念东，等．miR-132调控神经环路-突触可塑性与改善卒中后痴呆的机制研究[J]．中风与神经疾病杂志，2017，34(12)：1080-1083．

[3] 孙景波，华荣，何莉娜．清脑通络方对老年痴呆模型大鼠学习记忆功能的改善作用[J]．陕西中医，2009，30(8)：1095-1097．

[4] 饶燕，高洁，赖世隆，等．D-半乳糖合并Meynert基底核损毁对海马长时程增强和突触形态的影响[J]．中国应用生理学杂志，2002，18(1)：18-22．

[5] Bertoni-Freddari C，Fattoretti P，Casoli T，et al．Morphological plasticity of synaptic mitochondria during aging[J]．Brain Res，1993，628(1-2)：193-200．

[6] 邓家刚，郝二伟，范丽丽，等．中医药对老年性痴呆认识和防治的研究进展[J]．辽宁中医杂志，2007，34(11)：1659-1661．

[7] 符文彬，孙景波．张学文教授从肝论治脑病经验介绍[J]．新中医，2004，36(5)：14-15．

[8] Whitlock JR，Heynen AJ，Shuler MG，et al． Learning induces long-termpotentiation in the hippocampus[J]． Science，2006，313(5790)：1093-1097．

[9] 赵小贞，王玮，康仲涵，等．黄精口服液对血管性痴呆大鼠学习记忆与海马突触可塑性的影响[J]．神经解剖学杂志，2005，21(2)：147-153．