防感香佩包成分分析及其防治儿童上呼吸道感染作用机理研究

钱丹，韦力，郑梓培，黄向红

1.广州市越秀区儿童医院，广东 广州 510110；2.广州中医药大学中药学院，广东 广州 510006

上呼吸道感染(以下简称上感)虽然是一种自限性疾病，但由于儿童的体质特点，容易引起上感反复发作，严重影响儿童的生长发育甚至生活，因此防治工作尤为重要。笔者前期进行了小样本的临床试验，观察防感香佩包对儿童上感反复发作的预防作用，取得良好疗效[1]。后通过扩大样本量，设立多层次立体观察指标，分析防治儿童上感反复发作情况，防感香佩包能够明显降低儿童上感发作次数，缩短发作病程[2]。防感香佩包为佩戴使用，药效的发挥很可能与其所含挥发性成分通过呼吸吸入产生作用，为解释其临床疗效的可能作用机理，对防感香佩包中挥发油成分进行提取分离，深入探索其化学成分与临床疗效的相关性。

1 材料与方法

1.1 药物与器材 防感香佩包(广东源生泰药业有限公司制备)；7890B气相色谱仪；5977A型质谱联用仪(美国Agilent公司)；AgilentMassHunter Qualitatve Analysis B07.00数据处理系统；NIST标准质谱图库；HP-5ms Ulira Inert毛细管柱(30m×250μm× 0.25μm)。

1.2 挥发油提取分离 准确称取37包防感香佩包，置于烧瓶中，加入10倍量水与适量沸石，参照药典附录XD挥发油测定法连接挥发油提取器和冷凝管，定量加水至提取器。以提取挥发油出油率高低为评价指标，分别对浸泡时间(1、2、3、4 h)、提取时间(1、2、3、4、5 h)、料液比(5、10、20、30 倍)及提取次数(1、2、3次)进行考察，确定高出油率的提取分离条件。1.3 挥发油成分分析 GC-MS条件：色谱条件：进样口温度250℃；载气流速1mL/min；程序升温：起始柱温60℃，以5℃/min升温至120℃，再以1℃/min升温至160℃，保持1 min，最后以15℃/min升温至200℃；分流比为60∶1；进样量为1μL；载气为高纯氦气(99.99%)。

质谱条件：EI电离；离子源温度为230℃；四级杆温度：150℃：电子轰击能量70 eV；接口温度280℃；扫描模式m/z，扫描范围50～550；溶剂延迟3min。

1.4 统计学方法 所有数据均采用统计学软件SPSS13.0进行统计分析，计量资料以(±s)表示，采用t检验；计数资料采用 χ2检验。

2 结果

2.1 浸泡时间确定 见表1。准确称取37包样品，置于烧瓶中，加入10倍量水与适量沸石，参照药典附录XD连接挥发油提取器和冷凝管，定量加水至提取器，保持微沸3 h，记录挥发油体积，计算出油率，出油率=(出油量/样品重量)×100%，浸泡1 h出油率较高。

表1 浸泡时间对出油率的影响

2.2 提取时间确定 见表2。准确称取37包样品，置于烧瓶中，加入10倍量水与适量沸石，参照药典附录XD连接挥发油提取器和冷凝管，定量加水至提取器，保持微沸，记录挥发油体积，计算出油率，出油率=(出油量/样品重量)×100%，综合考虑能量损耗，确定提取时间为3 h。

2.3 料液比的确定 见表3。准确称取37包样品，置于烧瓶中，加入5、10、20、30倍量水与适量沸石，参照药典附录XD连接挥发油提取器和冷凝管，定量加水至提取器，定量加入环己烷，浸泡1 h，保持微沸3 h，记录挥发油体积，计算出油率，出油率=(出油量/样品重量)×100%，液比为1∶5时，出油率最高。

表2 提取时间对出油率的影响

表3 料液比对出油率的影响

2.4 提取次数的确定 见表4。准确称取37包样品，置于烧瓶中，加入5倍量水与适量沸石，参照药典附录XD连接挥发油提取器和冷凝管，定量加水至提取器，定量加入环己烷，浸泡1 h，保持微沸3 h，分别提取1、2、3次，记录挥发油体积，计算出油率，出油率=(出油量/样品重量)×100%，提取3次样品中挥发油基本提取完全。

表4 提取次数对出油率的影响

2.5 防感香佩包挥发油化学成分分析 见图1。根据出峰(保留时间)RT和丰度及峰面积等，经GC-MS对挥发油进行成分分析，匹配挥发油成分质谱谱库，发现挥发油中主要成分为倍半萜类(50%)和细辛醚类(43%)。

3 讨论

前期小样本临床试验研究发现，防感香佩包对儿童上感反复发作具有一定预防作用[1]，根据防感香佩包所含中药初步推测其作用机制为通过杀灭细菌或病毒，提高人体免疫力为主。因防感香佩包为佩戴使用，经呼吸进行给药，非口服给药，其疗效的发挥很可能与所含挥发油成分具有很大相关性。因此本研究通过提取分离收集挥发油，分析挥发油中主要有效成分，探索防感香佩包可能的作用机制。

通过考察防感香佩包中挥发油提取分离条件，出油率并非随着浸泡时间的延长而有所增加，说明经过长时间的浸泡，水溶性成分可以得到很好的溶出，但同时伴随着挥发性成分的损耗，提示在收集挥发油成分时，浸泡时间并非如收集水溶性成分那样呈现线性关系，而表现出类似于正态分布的情况。出油率虽随着提取时间的延长而增加[3]，但在提取3～4 h时，进入小的平台期，综合能量损耗考虑，最终确定3 h的提取时间。关于料液比的选择，随着浸泡水量的增加，出油率呈现下降趋势，提示在收集挥发性成分时，料液比要控制在较低比例，一方面可以避免挥发油损耗，另一方面可以降低能耗，提高提取效率。关于提取次数，随着提取次数的增加，出油率呈线性上升趋势，提示充分的煎煮冷凝回流能够提高出油率。以上关于防感香佩包挥发油部位的提取分离条件可为其他复方中挥发油的提取提供借鉴参考。

前期临床试验发现，佩戴防感香佩包的易感儿童，在发作次数、发作时间及时间间隔上都明显优于对照组，明显降低发作次数，并能够减少发病的持续时间，说明防感香佩包对儿童上感反复发作的防治疗效确切[2]。有研究对儿童上感反复发作的多种致病因素进行分析，均指向免疫力低下[4]。也有研究发现儿童上感的反复发作和儿童的体质有很大相关性[5]。说明免疫力低下的儿童，上感的易感性越强，反复发作次数愈多。佩戴防感香佩包能够减少发作次数，提示在提高儿童免疫力、增强体质方面有一定作用，方中主要含有的石菖蒲具有芳香辟秽、醒脾开窍的功效。石菖蒲挥发油中主要化学成分为细辛醚类，药理学研究表明，细辛醚能够提高气管平滑肌的抗过敏能力，对细胞损伤具有一定程度的保护作用[6]，对呼吸系统具有保护作用[7]，提高易感儿童对上感反复发作的抗病能力。本研究收集获得的细辛醚类占比高达43%，表明细辛醚在降低儿童上感反复发作次数方面具有明显药理作用。即使易感儿童上感发作，防感香佩包能够缩短病程，本研究获得挥发性成分中，倍半萜类占比约50%，具有较强的抑制病毒和抗菌的作用[8]，其为薄荷油主要挥发性成分之一，同时白芷中的挥发性成分也具有抗过敏、抗炎平喘作用[9]，细辛醚类也发挥着抑制气管平滑肌收缩和平喘的作用[10]，在共同作用下加快患儿发病期间的康复。

本研究通过提取分离收集挥发油中主要成分为倍半萜类(50%)和细辛醚类(43%)，对儿童上感反复发作的防治起到了关键作用。鼻腔为呼吸抵抗细菌和病毒的第一道防线，通过佩戴防感香佩包，细辛醚类通过呼吸经鼻腔吸收，通过鼻黏膜血管吸收和嗅黏膜途径可以直达脑组织[11]，具有一定脑靶向性，快速发挥其药效。中医认为石菖蒲具有开窍醒神的功效，提到的“窍”即为脑，这与中医传统的实践认知相一致。另外细菌和病毒易吸附在气道黏膜上，损伤黏膜上皮，降低呼吸道黏膜的防御能力[4]，引起儿童上感反复发作。通过在体和体外实验研究表明，细辛醚能够松弛气管平滑肌，延长哮喘发作，并能够促进气管纤毛的运动[12]。倍半萜具有一定的杀菌作用，对抗原基因有明显抑制作用，同时不影响人体正常细胞[13]，与中医理论“驱邪不伤正”的认知不谋而合。因此，防感香佩包用于防治儿童上感反复发作，其作用机理可能与所含挥发性成分细辛醚类和倍半萜类对上呼吸道的黏膜保护与抗病作用有关。

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