胆木和裸花紫珠多糖的分子量测定

蒲含林， 赖潜， 林顺权， 李秀峰， 袁晓

（1.暨南大学 生命科学技术学院细胞生物学系，广东 广州510632；2.海南制药厂有限公司，海南 五指山572200；3.广州牌牌生物科技有限公司，广东广州510540）

胆木（Nauclea Officinalis）原为海南民间用药材，始载于广州部队编《常用中草药手册》，由《中国药典》（1977年版1部）［1］收载.前期文献研究报道胆木的主要活性成分为生物碱类物质，其茎、茎皮和根均能入药，性味苦、寒，具有抗菌消炎、清热解毒、消肿止痛之功效，主要剂型有片剂和肌肉注射剂，临床用于上呼吸道感染的治疗有较好效果［2-4］.裸花紫珠Callicarpa nudiflora Hook.ex Arn.是马鞭草科紫珠属植物，以干燥叶和枝入药［5］，主要分布于我国的广东、海南和广西等省，在海南有大面积人工种植.有抗菌消炎、止血镇痛等功效［6-7］.裸花紫珠以单味药成药，主要剂型有胶囊、片剂，临床主要用于烧、烫伤外用救治和术后出血内服恢复，尤适用于妇科的产后恢复和炎症消退［8］.裸花紫珠入选《中国药典》2015年版新增中药品种，从裸花紫珠中发现的主要化学成分类型有苯丙素类、黄酮类、酚酸类、三萜类、二萜类、环烯醚萜类等［9-10］.胆木多糖和裸花紫珠多糖均为最先分离出的水溶性多糖，这里报道其分离纯化方法和分子量测定的结果.

电雾式检测器（charged aerosol detector，CAD）为新型检测器，可用于无紫外吸收化合物检测，与液相色谱分离系统联用，其重现性、稳定性很好，且灵敏度高，能准确地用于定量分析或半定量分析［11］.凝胶渗透色谱 （gel permeation chromatography，GPC）常被应用于高聚物的分子量及其分布的测定，有研究用GPC/LALLS仪检测多糖分子量、分子量分布［12］.金鑫等［13］用 GPC测量仙人掌多糖的相对分子量质量，本研究首先从胆木的水溶性部位分离出水溶性多糖，采用HPLC/CAD联合排阻色谱法测定胆木多糖的分子量和分子量分布，该方法检测结果直观、准确和快速，可以方便地推广到其他多糖类物质分子量的分析和测定.

1 材料和方法

1.1 试剂和仪器

1.1.1 试剂

超纯水，体积分数为95%药用酒精，纯化水，自制胆木多糖和裸花紫珠多糖，三氟乙酸.

1.1.2 实验材料

重均分子量（Mw）分别为 10 000、40 000、70 000、110 000、500 000的葡聚糖（山东西亚化学工业有限公司）；胆木药材和裸花紫珠药材（海南制药厂有限公司）.

1.1.3 仪器

Uplc DIONEX UltiMate 3000 RS pump（超高压液相色谱）；Rs Autosampler（双三元液相色谱泵）；Rs Column Compartment（RS柱室）；Corona Veo RS Charged Aerosol Detector（Corona Veo RS检测器）；工作站：Chromeleon 7 Extension Pack GPC Templates（变色龙色谱软件）；Thermo DIONEX ICS-5000+SP（戴安离子色谱仪）.

1.2 实验方法

1.2.1 色谱条件

色谱柱 Biobasic SEC 300（7.8 mm×300 mm，5μm）；流动相：超纯水；柱温：（35±0.5）℃；进样量：90μL；运行时间：30 min；流速：1.0 mL/min.

1.2.2 胆木多糖制备

取粉碎至10目左右的干燥的胆木药材200 g，用10、8和6倍体积分数为95%药用酒精回流提取3次后晾干酒精；药材再用10、8和6倍的纯化水煮沸提取3次，水提取液合并后减压浓缩至无酒精味，加入相当于浓缩液体积3倍体积分数的95%酒精使产生沉淀，离心并收获沉淀物，用体积分数为80%酒精溶液洗涤至洗出液无颜色，再用体积分数为60%酒精溶液洗涤至洗出液无颜色［14-15］，再用适量纯化水煮沸溶解，过滤弃去不溶物，将滤液用透析袋透析，上G100凝胶柱，水洗脱得到含糖部分，用高效液相凝胶色谱法联合CAD检测器测定分子量分布［16-17］.

1.2.3 裸花紫珠多糖的制备

将阴干的裸花紫珠材料用15倍质量，体积分数为95%的乙醇在室温下浸泡4～6 h后滤出乙醇溶液，同法反复浸泡提取3～4次，合并醇提液回收乙醇；倒出乙醇提取过的裸花紫珠叶至干净的台面上，晾干叶片上的残余乙醇.用裸花紫珠叶10～20倍质量的水煮沸30 min，冷至50～60℃后倾出；同法用水再提取1次，合并水提取液减压浓缩至溶液体积为100mL左右，得到裸花紫珠叶水提取物.向水提取液中加入水溶液质量3～4倍体积分数为95%的乙醇，有絮状沉淀物析出，移出沉淀上部的醇溶液，反复水溶醇沉至醇洗上清液无色为止.将初步纯化的裸花紫珠多糖用纯化水溶解后放入透析袋中，再将透析袋放入盛纯化水的容器内，透析48 h，将透析液上G-100葡聚糖凝胶柱，水洗脱，收集含糖组分［18-19］.

1.3 仪器精密度、稳定性考察

1.3.1 精密度考察

精密称取重均分子量（Mw）为70 000的葡聚糖对照品适量，配成质量浓度为1.0 mg/mL溶液，经0.22μm的微孔滤膜过滤.连续进样5次，以保留时间和峰面积的变化来考察精密度.

1.3.2 稳定性考察

将胆木多糖样品按1.3.1实验条件平行操作，每1 h测定1次，测定5次，分别测定其峰面积和保留时间，考察其稳定性.

1.4 胆木多糖分子量分布测定

1.4.1 标准品的配制

标准品配制：精密称取重均分子量Mw分别为 10 000、40 000、70 000、110 000、500 000的5种葡聚糖对照品适量，配成质量浓度为1.0 mg/mL的标准溶液，经0.22μm的微孔滤膜过滤，进样.

记录色谱图，用Chromeleon 7 Extension Pack GPC Templates软件以标准葡聚糖重均分子量Mw的对数logMw为y坐标，以保留时间Tr为x坐标对其进行回归处理，用三次方程y＝C3x3+C2x2+C1x+C0进行拟合作为校正曲线.

1.4.2 供试品的配制

供试品溶液的制备：精密称取胆木多糖和裸花紫珠多糖适量，用60℃热水溶解，配制质量浓度为1.0 mg/mL供试品溶液，0.22μm的微孔滤膜过滤.

1.4.3 胆木和裸花紫珠多糖分子量和分子量分布测定

供试品溶液按1.2色谱条件进样，记录图谱，得到供试品分子量分布图及数均分子量（Mn）、重均分子量（Mw）、Z均分子量（Mz）、Z均分子量（Mz）+1.

2 结果与分析

2.1 精密度和稳定性考察结果与分析

2.1.1 精密度考察

经5次进样后，葡聚糖的凝胶色谱峰的保留时间和峰面积如表1所示，保留时间相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为 0.90%，峰面积RSD为1.83%.可见，精密度良好，仪器连续进样误差较小.

2.1.2 稳定性考察

由表2可见，样品多糖的峰面积和保留时间的RSD分别为0.31%和0.99%，可知仪器稳定性良好，试验误差较小.

表2 稳定性考察结果Table 2 Stability study results

2.2 多糖分子量及分子量分布测定结果

2.2.1 标准曲线

已知分子量的标样葡聚糖溶液按上述方法条件测定，获得重均分子量对数值LogMw和保留时间Tr（表 3、图 1）.

表3 LogMw和T rTab le 3 LogMw and T r

回归方程为 logMw＝-0.069Tr3+1.539Tr2-11.542Tr+33.940

2.2.2 分子量分布图

胆木多糖的分子量分布和分子量积分分布见图2和图3.

裸花紫珠多糖的分子量分布和分子量积分分布见图4和图5.

2.2.3 Mn、Mw、Mz、Mz+1计算结果

图1 葡聚糖系列标准品的回归曲线Fig.1 Glucan standard series of regression curves

计算结果显示（图6、图7），胆木多糖的重均分子量Mw为2.6×105，分子量分散系数为1.13，分布带较窄；裸花紫珠的重均分子量Mw为1.68×105分子量分散系数为4.45，分布带较宽.

图2 胆木多糖分子量分布曲线Fig.2 Polysaccharide molecular weight distribution curve of Nauclea officinalis

图3 胆木多糖分子量积分分布曲线Fig.3 Polysaccharide molecular weight distribution curve of Nauclea officinalis

图4 裸花紫珠多糖的分子量分布曲线Fig.4 Polysaccharides molecular weight distribution curve of Callicarpa nudiflora

图5 裸花紫珠多糖分子量积分分布曲线Fig.5 Polysaccharides molecular weight distribution curve of Callicarpa nudiflora

表4 胆木多糖分子量分布数据Table 4 Polysaccharide molecular distribution data of Nauclea officinalis

表5 裸花紫珠多糖分子量分布数据Table 5 Polysaccharides molecular weight distribution data of Callicarpa nudiflora

3 讨论

测定大分子物质的分子量除了用凝胶柱的高效液相色谱配合不同类型的检测器以外，还有光散射法和渗透压法等测定大分子物质的分子量和分子量分布的方法，不同方法所测得的分子量及其分布会有不同程度的误差.本实验选用HPLC/CAD联合凝胶色谱法测定胆木多糖的分子量及其分布，并对此方法进行了精密度和稳定性考察，证明该法具有操作简便、灵敏度高、稳定性好、准确性高以及重现性好的特点，另外CAD检测的原理是把样品雾化，通过检测分子的体积大小转换成分子量，与激光光散射仪测定的原理相似［20］，误差较小，数据处理简便，结果准确可靠.此法所测得的胆木多糖的 Mw为 2.61×105，Mn为 2.30×105，Mz为 2.85×105，Mz+1为 3.02×105，分子量分散系数为1.13，分布较窄；图2胆木多糖分子量分布曲线与图3均能清晰反映高聚物的分布宽度，较好地反应了胆木多糖中1种组分的分子量及分子量分布.此法所测得的裸花紫珠多糖的Mw为7.47×105，Mn为 1.68×105，Mz为 5.13×106，Mz+1为1.29×107，分子量分散系数为 4.45，分布较宽；分子量分布曲线和分子量分布积分曲线显示软件自动积分时取值范围较宽，能够在一定程度上反应所测定的物质的分子量和分子量分布，但分布范围较宽，这可能主要与样品的质量浓度和凝胶柱的柱效有关.

试验中标准物质的选择也会对测定的结果有一定的影响，对于多糖中单糖组成的主要部分是葡萄糖的样品，以葡聚糖作为标准产生的误差会较小，单糖组成分析实验证实胆木和裸花紫珠水溶性多糖的主要单糖组成均是葡萄糖.另外利用CAD检测器的方法对于分析测定初步纯化后的多糖中含有几个多糖组分也非常方便和实用，对紫外无吸收，折光检测不灵敏的大分子物质的分子量和分子量分布测定也有良好的效果.

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