高效液相色谱法测定茄蒂中α-茄碱的不确定度评定
2018-07-03刘艳芳尚岩岩张德欣
郭 斌，刘艳芳，尚岩岩，张德欣
茄子在我国种植范围非常广泛，是我国居民日常生活中的一种常见蔬菜。茄子不仅营养丰富，味道鲜美，并且价格低廉，深受广大消费者的喜爱[1]。茄子浑身是宝，不仅食用价值很高，还具有抗癌、抗衰老、降血脂血压、消炎止痛、降热止血等多种生理功效，具备一定的药用价值[1-3]。研究表明，此类生理功效主要由茄子植物体内含有的糖苷生物碱贡献。茄子非可食部在日常生活中往往作为废弃物被弃之不用，而α-茄碱在茄子非可食部分中(尤其是茄蒂中)分布较为可观。目前，针对茄子非可食部分中α-茄碱的系列研究并不多见[4]。现行检测方法中，高效液相色谱法效果较好[5]。能够准确测定茄子非可食部分中的α-茄碱含量，是研究利用α-茄碱的前提条件。本研究根据JJF1059-2012《测量不确定度评定与表示》和CNAS-GL06《化学分析中不确定度的评定指南》中规定的方法和程序，分析HPLC法测定茄子非可食部分(茄蒂)中α-茄碱的各不确定度分量来源，并定量计算，可有效提高测定茄子非可食部分中α-茄碱含量的准确程度[6-8]。
1 材料与仪器
1.1 主要材料与药品
茄子非可食部分样品购买自阜阳市本地的大润发和永辉超市，采用随机采样原则，收集茄蒂部分待前处理。
α-茄碱标准样品：购自美国Sigma公司(纯度99%)，使用甲醇作为溶剂稀释，配制为浓度为100 μg/mL的标准样品储备溶液；甲醇(国药化学试剂，色谱级)；乙腈(TEDIA，色谱级)。
1.2 仪器设备
高效液相色谱仪(日本日立公司，L-2000型)；紫外检测器(日本日立公司，L-2420型)；高速粉碎机(北京西化仪)；超声波清洗机(昆山固特)；旋转蒸发仪(上海亚荣)；C18液相色谱柱(Grace)；pH计(上海雷磁)。
1.3 样品前处理
将收集到的茄蒂样品于烘箱中以60 ℃烘干，使用高速粉碎机粉碎并过50目筛(孔径0. 28 mm)，装入离心管并贮于干燥器内备用。取10.00 g制备好的茄蒂样品，用300 mL 80%的甲醇溶液溶解，在40 ℃下以超声波提取40 min，抽滤后以少量2% HCl溶解滤液，调节pH为2-3，过滤后用15 mL氯仿萃取2次，弃去有机相；水相用0.5%的NaOH调节pH至11，再以100 mL氯仿分3次萃取，合并收集到的萃取液，于旋转蒸发仪上蒸干后用10 mL甲醇溶液溶解瓶壁残留物，在40 ℃下超声洗脱40 min备用[9-10]。
1.4 高效液相色谱条件
采用HPLC-UV法。色谱柱：Grace C18 150 mm×4.6 mm(i.d),粒径5 μm；流动相：Tris-HCl缓冲液(pH=7.40)-乙腈(75+25,v/v)；流速：0.8 mL/min；柱温：25 ℃；检测波长：280 nm；进样量：20 μL；色谱柱平衡时间：20 min。
1.5 数学模型
茄蒂中α-茄碱的含量计算公式为：
式中：X——茄蒂试样中α-茄碱的含量，(mg/g)；m——由标准曲线得出的进样20 μLα-茄碱的质量，(mg)；V——样品液最终洗脱体积，(mL)；M——茄蒂试样的质量，(g)；
20——进样体积，μL；P——加标回收率。
2 结果与分析
2.1 标准溶液的配制与测定
分别吸取0.5、1、2、4、8、16 mL α-茄碱标准样品储备溶液于100 mL容量瓶中，以甲醇定容。配制α-茄碱标准样品工作溶液浓度分别为15、30、60、120、240、480 μg/mL，上机测定，每组设置重复样三个，标准样品工作溶液浓度测量结果见表1。
表1 α-茄碱标准品测量结果表
2.2 标准曲线方程
由表1中结果平均值拟合标准曲线方程：Y=131 401X+7 147.3,R2=0.999 9。α-茄碱标样工作溶液浓度(μg/mL)为横坐标X；峰高(H)为纵坐标Y。
2.3 α-茄碱含量测定结果不确定度来源的分析
以1.5中的数学模型作为分析基础，可得，不确定度的来源主要有：(1)α-茄碱标准物质自身；(2)标准溶液的配制过程；(3)标准曲线；(4)待测样品设置的重复样；(5)加标回收率P。
2.4 各类来源不确定度的计算
2.4.1 来自α-茄碱标准物质自身的不确定度 在α-茄碱标准物质证书中，α-茄碱标样纯度为，纯度偏差，根据JJF1059-2012，依据正态分布规律考虑，包含因子，则来自α-茄碱标品自身的相对不确定度为[6]：
2.4.2 α-茄碱标样储备溶液配制的不确定度α-茄碱标样储备溶液的浓度为3.000 mg/mL，具体配制方法为：称量0.300 0 gα-茄碱标样，以甲醇溶解并定容至100 mL容量瓶中。
称量α-茄碱标样时，需使用最大允许误差为的电子天平。在置信区间为99%，包含因子k=3的情况下，依据正态分布规律考虑，则因称量引入的标准不确定度为：
而α-茄碱标样的称量质量为0.300 0 g，则来自称量α-茄碱标样的相对不确定度：
表2 配制α-茄碱标样工作溶液各种玻璃量具的不确定度
则配制α-茄碱标样工作溶液的各种玻璃量具的不确定度：
2.4.4 来自标准曲线的不确定度 由2.2中的标准曲线方程可得，a=131 401,b=7 147.3。峰高Y测量的标准偏差SH为：
待测样品测量次数为平行重复测量3次，则p=3，经过计算得到待测样品中α-茄碱的估计值含量为0.465 2 mg/g。
由拟合标准曲线时引入的标准不确定度为：
2.4.5 来自茄子非可食部(茄蒂)试样的不确定度 茄蒂试样的取样质量为10.00 g。查阅称量用电子天平的鉴定证书，可知其最大允差为±0.5 mg，重复性误差为±0.1 mg，因此，按照均匀分布原则，来自茄子非可食部(茄蒂)试样的相对不确定度为：
2.4.6 提取茄蒂试样中的α-茄碱过程中引入的不确定度 提取茄蒂试样中的α-茄碱时需加入10 mL甲醇溶解，而移液使用的10 mL A级刻度吸管最大允差为，按照均匀分布原则，提取茄蒂试样中的α-茄碱过程中引入的相对不确定度为：
2.4.7 来自重复样的不确定度 设置待测茄蒂试样重复测量次数为6次，试样中α-茄碱含量分布情况见表3。
表3 待测茄蒂试样中α-茄碱的含量分布(mg/g)
2.4.8 加标回收率的不确定度 设置加标回收率实验的主要目的是为了评价前处理操作过程对实验结果的影响。五次加标回收率实验的结果分别为97.33%、94.60%、96.00%、98.20%和95.93%，加标回收率平均值为96.41%。则加标回收率P的标准偏差为：
因此，加标回收率的相对不确定度：
2.5 α-茄碱含量合成标准不确定度
综合上述不确定度分量结果，合成标准不确定度可计算为：
=1.288×10-2
2.6 扩展不确定度的计算
根据JJF1059-2012，在置信区间为95%，包含因子k=2的情况下，扩展不确定度由合成标准不确定度与包含因子的相乘可得。因此，扩展不确定度为：
由表3可知茄蒂试样中α-茄碱含量的最佳估计值为0.465 2 mg/g。因此，在置信区间为95%，包含因子k=2的情况下，茄蒂试样中α-茄碱的含量可以表示为(0.465 2±0.012 0)mg/g。
3 结 论
针对茄子中非可食部分(茄蒂)中α-茄碱的检测，由于待测样品的前处理方法较为繁杂，需要多种溶剂采用不同的方法反复提取，测量结果容易受到提取率、玻璃量具等因素的影响。本文通过HPLC-UV法对茄蒂中α-茄碱含量的不确定度分析和评定，评定结果表明各不确定度分量按照影响准确度的严重程度排列顺序为加标回收率引入、配制标准物质工作溶液引入、拟合标准曲线引入、标准物质引入、使用甲醇提取茄蒂试样时引入、配制标准储备溶液使用的容量瓶引入、重复性实验引入、称量试样引入和称量标准样品引入。
综上所述，在测定茄子非可食部分(茄蒂)中α-茄碱的过程中，可通过以下途径提高实验结果的准确性，减少各不确定度分量的来源：(1)优化前处理工艺，提高加标回收率；(2)提高溶液配制的技术要求和精细程度；(3)增加测定标准曲线校正点的重复次数等。
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