北京棒杆菌AS 1.299发酵生产蛋氨酸的营养条件优化

◎ 刘俊琦，于金龙，宋凤亮

（1.吉林大学动物科学学院，吉林 长春 130000；

2.长春大成实业集团有限公司，吉林 长春 130000）

L-蛋氨酸（L-methionine）是一种含硫的氨基酸，是人体8种必需氨基酸中仅有的含硫氨基酸，与L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-异亮氨酸共同属于天冬氨酸的成员。蛋氨酸是含有1个氨基和1个羧基的中性氨基酸，小类又归属于非极性R基氨基酸。1个甲硫基（-SCH3）连接在C位碳原子上，因而也得名甲硫氨酸[1-3]。目前，天冬氨酸家族氨基酸除了L-蛋氨酸外，L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-异亮氨酸在数年之前，就已经实现高产的发酵法生产。因此，学者对于研究蛋氨酸的高产发酵法非常热衷。本文采用的出发菌株为北京棒杆菌AS 1.299。

微生物的生命活动都与周围的生长环境息息相关，改变环境中的任何一个条件都会影响微生物的生命活动和生理状态，因此，适宜的生长环境对于维持微生物生长或发酵产物生产的平稳或特需至关重要。本文对北京棒杆菌AS 1.299发酵产蛋氨酸的营养条件进行优化研究，确立最优的摇瓶产酸条件，以实现蛋氨酸的高产。

1 试验材料与方法

1.1 菌种

北京棒杆菌AS 1.299，由实验室筛选提供。

1.2 培养基[8]

完全培养基（C.M）配制方法：液体培养基含有0.3%牛肉膏、1%蛋白胨和0.5% NaCl，调节pH为7.0～7.2；固体培养基配制需在液体基础上加1.5%营养琼脂。

种子培养基（S.M）配制方法：0.5%酵母浸膏、2%蛋白胨和0.3%的尿素作为氮源，4%的葡萄糖作为碳源，盐类含K2HPO4和MgSO4·7H2O，含量各为0.05%，KH2PO4含量为0.15%，调节pH为7.0～7.2。

发酵培养基（F.M）配制方法：含有0.4% (NH4)2SO4和0.1%的尿素作为氮源，4%的葡萄糖作为碳源，盐类含KH2PO4和MgSO4·7H2O，含量各为0.05%，此外金属盐类含有 MnSO4·H2O 和 FeSO4·7H2O，含量各为0.02%，添加浓度为5 µg/100 mL的生物素以及浓度为200 µg/100 mL的硫胺素，调节pH为7.0～7.2；固体培养基需在此基础上加2%琼脂。

1.3 仪器

GTR10-2型高速冷冻立式离心机（北京时代北利离心机有限公司），HWS-250型恒温恒湿培养箱（上海印溪仪器仪表有限公司），HY-4型往复式调速多用振荡器（上海印溪仪器仪表有限公司），SW-CJ-2D（G）型净化工作台（上海印溪仪器仪表有限公司），AUY22O型分析天平（日本岛津），LDZX系列智能型高压蒸汽灭菌锅（上海茸研仪器公司），大龙Dragon TopPette移液器，UV1700型紫外可见分光光度计（日本岛津）。

1.4 试验方法

1.4.1 蛋氨酸标准曲线的绘制[6]

对层析纸进行划线处理，通常选上端1 cm处和下端2 cm处各画一条直线，把蛋氨酸标准液配成0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 g/L和4.5 g/L共9个浓度，然后以相同的间距在层析纸下端直线上进行点样，把含有样品的层析纸置于层析液中，按照层析、干燥、显色、洗脱的过程进行处理。然后把洗脱处理的样品置于比色皿中，选取蒸馏水为对照，检测波长512 nm下的吸光度值（OD）并构建坐标系，其中纵坐标为蛋氨酸含量，横坐标为OD值，绘制蛋氨酸的标准曲线。

1.4.2 菌体浓度的测定[7]

把培养好的菌液稀释相同的倍数，在660 nm波长下测定不同培养基中菌液的光密度值，光密度值越大，代表菌体浓度越大。

1.4.3 碳源的确定[8]

将发酵培养基置于三角瓶中，选一个无碳源的作为空白对照，分别需要三组平行。进行高压蒸汽灭菌，冷却后接种北京棒杆菌AS 1.299，接种量为8%，30 ℃摇床培养2 d（速度180 r/min），取离心后的发酵液中的上清液，测洗脱液的OD值，通过蛋氨酸标准曲线获得相应蛋氨酸的产量，确定最佳碳源[9]；在此基础上进行单因素试验，配制碳源浓度分别为4%、6%、8%、10%、12%和14%的发酵培养基，确定碳源的最适浓度。

1.4.4 氮源的确定

将发酵培养基置于三角瓶中，其他操作同1.4.3，确定发酵产蛋氨酸的最佳氮源[10-11]，在此基础上进行单因素试验，配制氮源浓度分别为0.3%、0.5%、0.7%、0.9%和1.1%的发酵培养基，确定氮源的最适浓度。

1.4.5 金属离子的确定

按1.2方法配制MgSO4·7H2O浓度为0.03%、0.05%、0.07%、0.09%和0.11%发酵液，然后分装在3个三角瓶中，并且都做3个平行。以尿素为氮源，在121 ℃的条件下灭菌20 min，其他同上。

1.4.6 生物素浓度的确定

分别配制生物素浓度为1、3、5、7、9 µg/100 mL和11 µg/100 mL的发酵液，并且分装在三角瓶中，且金属离子MgSO4·7H2O的浓度确定为0.07%，其他同上。

1.4.7 营养条件的正交试验

以单因素试验结果为根据，正交优化设计各个单因素，见表1。

表1 L9（34）正交试验因素水平设计表

2 结果与分析

2.1 蛋氨酸的标准曲线

蛋氨酸含量与OD值呈线性关系，如图1所示。得到的回归方程为Y=61.976X-0.169 1（Y表示蛋氨酸含量，X表示OD值），其相关系数为R2=0.996 9；说明蛋氨酸含量与OD值线性回归比较显著。

图1 标准曲线图

2.2 不同碳源及碳源浓度对菌体浓度和蛋氨酸产量的影响

从2图中可以看出，以葡萄糖作为培养基的碳源对产生蛋氨酸和菌体生长最有利。而通过空白对照发现，缺乏碳源，不利于菌体生长，并且基本不产生蛋氨酸。图3结果表明，蛋氨酸的产量在很大程度上受到葡萄糖浓度的影响，菌体的浓度和蛋氨酸的产量都是随着葡萄糖浓度的增大而增大。菌体浓度和蛋氨酸产量在葡萄糖浓度为8%时达到最大值，随着葡萄糖浓度的继续增大，菌体浓度和蛋氨酸产量都有所下降。更深入的研究发现，当培养基中葡萄糖浓度达到一定高度值时，发酵液中的渗透压就会升高，菌体细胞在高渗透环境中会渗出大量水分、电解质，影响菌体的生长，进而影响蛋氨酸的产量。由此可以得出，碳源是微生物菌体生长的必备营养条件，而葡萄糖与其他碳源相比较，效果最好。但是适宜的葡萄糖浓度对于菌体的生长和蛋氨酸的产量也是至关重要的，浓度过高或者过低都无法保证菌体的正常生长，这与国内外的大多数研究报道结果相符。

图2 不同碳源对蛋氨酸产量和菌体浓度的影响图

图3 不同葡萄糖浓度对蛋氨酸产量和菌体浓度的影响图

2.3 不同氮源及氮源浓度对菌体浓度和蛋氨酸产量的影响

不同氮源对蛋氨酸产量的影响如图4所示。图中结果表明，5种氮源中，尿素对菌体的生长和蛋氨酸的合成非常有利。其中，不加其他溶液，只把单独的尿素作为氮源时，菌体的浓度和蛋氨酸的含量都达到了最高值。不同尿素浓度对菌体浓度和蛋氨酸产量的影响如图5所示。当尿素浓度从0.3%增大到0.5%时，菌体浓度和蛋氨酸的产量随着尿素浓度的增大而增加。当浓度达到0.5%时，菌体浓度和蛋氨酸产量达到最大值。但当尿素浓度继续增大到1.1%时，菌体浓度和蛋氨酸产量反而出现了下降的趋势。通过深入研究发现，当尿素的浓度达到一定值时就会抑制菌体的生长，进而导致蛋氨酸的产量下降。由此可以得出，氮源对微生物菌体生长至关重要，而且不同的氮源对菌体浓度与蛋氨酸产量的影响非常显著，而尿素与其他氮源相比较，效果最好。但是适宜的尿素浓度对于菌体的生长和蛋氨酸的产量也是至关重要的，浓度过高或者过低都无法保证菌体的正常生长，这个结果也与国内外的大多数研究报道结果相符。

图4 不同氮源对蛋氨酸产量和菌体浓度的影响图

图5 不同尿素浓度对蛋氨酸产量和菌体浓度的影响图

2.4 不同浓度金属离子对菌体浓度和蛋氨酸产量的影响

不同浓度MgSO4·7H2O对菌体浓度和蛋氨酸产量的影响如图6所示。Mg2+是调节微生物生命活动的重要无机盐离子，它是酶活性基团等的重要构成部分，对激活酶活性也起着重要作用，从而促进菌体生长。从图中可知，菌体浓度和蛋氨酸产量随着MgSO4·7H2O浓度的增大而增大，MgSO4·7H2O浓度为0.07%时，菌体浓度和蛋氨酸产量达到最大值，继续增加MgSO4·7H2O浓度，菌体浓度和蛋氨酸产量都下降。此实验结果表明，金属离子是菌体生长和产蛋氨酸的必备条件，而且适宜的离子浓度才能获得高产量的蛋氨酸，浓度过高或者过低都会影响相关酶的活性，进而影响菌体浓度以及蛋氨酸的产量。

图6 不同金属离子浓度对蛋氨酸产量和菌体浓度的影响图

2.5 不同生物素浓度对菌体浓度和蛋氨酸产量的影响

图7表明，不同生物素浓度对蛋氨酸产量的影响很明显。从图中的整体趋势可以看出，过高或者过低的生物素浓度都会影响菌体浓度和蛋氨酸的产量，当生物素浓度低于5 μg/100 mL时，菌体浓度和蛋氨酸产量随着生物素浓度增大而逐渐增多，当浓度达到5 μg/100 mL时，菌体浓度和蛋氨酸产量增加最多。当生物素浓度较高时，菌体浓度和蛋氨酸产量随着其浓度的增加反而都有下降的趋势。研究发现，生物素是菌体生长的一种重要生长因子，也是棒杆菌属菌体发酵产蛋氨酸所必需的成分。而且，为了获得高产量的蛋氨酸，生物素的浓度也要在合理的范围内，超出一定的范围，都会抑制菌体的生长进而影响蛋氨酸的产量。大量的国内外文献研究表明，菌体的生长对生物素浓度的要求极高，要想获得高产量的蛋氨酸，必须浓度适宜。

图7 不同生物素浓度的作用图

2.6 营养条件正交实验结果分析

从表2中可以看出，碳源、氮源、金属离子和生物素对蛋氨酸产量的影响大小为C>A>B>D，金属离子的影响最大，其次是葡萄糖和尿素，影响最小的是生物素，最佳条件组合为A2B1C2D3，即葡萄糖8%、尿素0.6%、MgSO4·7H2O 0.07%、生物素 5 µg/100 mL，此条件下蛋氨酸产量为2.326 g/L。

表2 L9(34)正交试验因素水平表

3 结论

本文采用北京棒杆菌AS 1.299为出发菌株发酵生产蛋氨酸，研究了葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖以及无碳源对菌体浓度和蛋氨酸含量的影响，结果表明葡萄糖为最适宜碳源。研究了0.5%尿素、0.5%(NH4)2SO4、0.5%(NH4)2HPO4、(NH4)2SO4和尿素比例4∶1、(NH4)2HPO4和尿素比例4∶1、(NH4)2SO4和(NH4)2HPO4比例1∶1作为氮源对对菌体浓度和蛋氨酸含量的影响，结果表明只有尿素为最适宜氮源。单因素的实验结果表明，葡萄糖的最佳浓度为8%、尿素的最佳浓度为0.5%、MgSO4·7H2O的最佳浓度为0.07%、生物素的最佳浓度为5 μg/100 mL，在单因素实验基础上进行正交实验设计，对蛋氨酸含量的影响顺序是MgSO4·7H2O＞葡萄糖＞尿素＞生物素，最佳营养条件组合为葡萄糖8%、尿素 0.6%、MgSO4·7H2O 0.07%、生物素 5 μg/100 mL时蛋氨酸产量为2.326 g/L。

[1]程 丽，闵伟红，贾彦明，等.产蛋氨酸菌株选育研究进展[J].农产品加工学刊，2011（5）：112-114.

[2]容 庭，陈 庄，何 前，等.蛋氨酸在肉，蛋鸡生产中的应用研究进展[J].饲料博览：技术版，2008（1）：19-22.

[3]李戍江，杨开伦，禚 梅，等.包被蛋氨酸和赖氨酸对奶牛产奶性能的影响[J].草食家畜，2009（1）：47-49.

[4]刘玉兰，宋国隆，侯永清，等.Alimet和DL-蛋氨酸对肉仔鸡胴体品质影响的比较研究[J].中国家禽，2005，27（10）：14-17.

[5]马桂燕.2012年蛋氨酸市场回顾及2013年展望[J].饲料广角，2013（6）：31-33.

[6]杨晓玲，赵宗云，刘永军，等.应用纸层析分离鉴定氨基酸方法的改进[J].植物生理学通讯，2002，38（4）：368.

[7]周林芳，李淑华，顾晓梅，等.微生物发酵产蛋氨酸的研究[J].氨基酸和生物资源，2013，35（4）：51-56.

[8]程 丽.双重营养缺陷型菌株筛选及其发酵产蛋氨酸的研究[D].长春：吉林农业大学，2011.

[9]松田敦郎.全球蛋氨酸市场格局变化及价格趋势分析[J].北方牧业，2010（11）：12.

[10]闫洪颖，孙 峰.2010年中国蛋氨酸市场回顾及2011年展望[J].中国畜牧杂志，2011，47（4）：27-30.

[11]闵伟红，林小秋，冯 琦，等.抗蛋氨酸结构类似物突变株的筛选[J].吉林大学学报（理学版），2009，47（40）：840-845.