HPLC-MS/MS法测定依卡倍特钠原料药中潜在遗传毒性杂质

丁希颖，吉小龙，李 博，毛白杨，严 方*，狄 斌**

(1中国药科大学江苏省药物分子设计与成药性优化重点实验室，南京 210009；2中国药科大学药物分析系，南京 210009；3亚邦医药研究院合成部，常州 213161；4常州亚邦制药有限公司,常州 213161)

药物中含量很低的遗传毒性杂质，都可能会引起人体基因发生突变或染色体断裂和重排，进而引发肿瘤[1-2]。2006年起，欧洲药品管理局(EMA)、美国食品药品监督管理局(FDA)、人用药品注册技术要求国际协调会议(ICH)陆续对遗传毒性杂质的控制做出特别规定。科学家们一方面致力于准确有效地评价[3-4](Ames Ⅱ试验、彗星试验和流式细胞术检测微核试验等)或预测[5](QSAR等)化合物的遗传毒性；另一方面，针对原料药中痕量(根据ICH M7通用原则中毒理学关注阈值TTC计算)遗传毒性杂质，也建立了很多快速高效的分析方法(LC-MS、GC-MS、LC-MS/MS、HPLC衍生化等[6-9])。尤其在化合物安全性数据不足的情况下，任何含有警示结构[2]的化合物均应该引起人们的重视，区别于一般的杂质来进行监管。

依卡倍特钠(ecabet sodium)作为一种传统的抗溃疡药物，可以抗菌、消炎和抑制胃酸分泌。其抗溃疡的主要作用机制是形成一层保护膜覆盖在炎症受损处[10]。此外依卡倍特钠还能治疗胃部幽门螺杆菌感染[11]；也常被用来与其他药物联合使用治疗胃溃疡[12]。

依卡倍特钠由依卡倍特经过成盐反应得到。而依卡倍特具有苯磺酸的结构，其在成盐工艺中使用乙醇作为溶剂，因此很有可能会产生包含遗传毒性警示结构(苯基磺酸酯[2])的杂质(杂质Ⅰ)，其分子式为C22H32O5S，化学结构式见图1。该杂质属于ICH M7指导原则中第3类杂质(无遗传毒性数据、含有与原料药结构无关的警示结构)。考虑到依卡倍特钠最大服用剂量较大(每日2 g)，如果按照TTC的计算方法(根据ICH M7通用原则中的相关规定)，该类遗传毒杂质的含量(×10-4%)不得超过0.75，因此，急需开发一种灵敏度高且专属性强的定量分析方法。

文献检索结果显示，对于依卡倍特钠有关物质的考察大多停留在总杂质和非特异性杂质、降解杂质上，未见文献关注过遗传毒性杂质[13-14]。本文提到的潜在遗传毒性杂质为有机酯类，极性弱，在日本药典方法和现有文献方法条件下很难被洗脱；此外，现有的HPLC方法灵敏度也不适用于遗传毒性杂质的分析。在文献报道的基础上[15]，本研究通过改变流动相比例和pH以及检测手段建立HPLC-MS/MS分离法，用于依卡倍特钠原料药中的遗传毒性杂质的检测。

Figure1 Chemical structure of potential genotoxic impurity in ecabet sodium (Imp-I)

1 材 料

1.1 试 剂

依卡倍特钠样品(批号：CPC-055-1702001、CPC-055-1702002、CPC-055-1702003、ZJT-161-1702001、ZJT-161-1702002、ZJT-161-1702003，常州亚邦制药有限公司)；甲醇和乙腈(色谱纯，美国Tedia有限公司)；超纯水(由美国Millipore-Q超纯水仪自制)；其他试剂均为市售分析纯。

1.2 仪 器

UltiMate3000型液相色谱仪(美国戴安公司)；配备电喷雾离子源的Thermo Finnigan TSQ三重四极杆质谱，Thermo Syncronis C18色谱柱(4.6 mm×150 cm，5 μm)(美国赛默飞世尔科技公司)；Agilent 6200型飞行时间质谱(美国安捷伦科技有限公司)；Bruker AV500 MHz 傅里叶变换-核磁共振仪(美国布鲁克科技有限公司)。

2 方法与结果

2.1 杂质Ⅰ的合成

将依卡倍特(50.00 g,131.58 mmol)和甲苯(300 mL)分别加入500 mL三颈瓶中，室温条件下搅拌。向反应液中缓慢地滴加二氯亚砜(100 mL)，滴毕，将反应液加热至回流状态,在回流过程中，固体完全消失,形成红色澄清溶液。保持回流状态3～4 h，反应结束后减压浓缩得大量的黄色固体。将黄色固体加入四氢呋喃水溶液(400 mL,1∶6)中，室温下搅拌17 h至反应结束。减压除去反应液中的THF，形成含有水的黄色黏稠状物，用甲基叔丁基醚(3×100 mL)萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩后得黄色固体(50.00 g,95.29%)。取黄色固体粗品20.00 g溶解在乙醇750 mL中，冰水浴下冷却至4 ℃。保持该温度，滴加氢氧化钠水溶液(2.75 mmol,50 mL)，继续搅拌30 min。然后滴加10%稀盐酸，直到pH 2～3不再滴加，滴加过程中内温不超过5 ℃。过滤，取部分滤饼柱色谱纯化得到产品(100 mg,99.9%)。MS：m/z407.2[M-H]-;1H NMR(DMSO-d6,500 MHz):2.30(1H,d,J=12.10 Hz,-CH2),1.51(2H,m,-CH2),1.85(4H,m,-CH2),1.63(1H,m,-CH2),1.85(4H,m,-CH2),2.07(1H,d,J=12.15 Hz,-CH),2.91(1H,m,-CH2),3.03(1H,dd,J=6.15～6.30 Hz,-CH2),1.51(2H,m,-CH2),1.85(4H,m,-CH2),7.74(1H,s,Ar-H),7.35(1H,s,Ar-H),3.67(1H,t,J=6.55 Hz,-CH),1.23(15H,m,H-16,17,18,19,22,5-CH3),4.06(2H,d,J=6.75 Hz,-CH2)。杂质Ⅰ合成路径见图2。

Figure2 Synthetic route of Imp-I

2.2 色谱-质谱条件

采用Thermo Syncronis C18色谱柱(15 cm×4.6 mm,5 μm)，流动相A相为5 mmol/L乙酸铵溶液(用甲酸调节pH至3.0)，B相为纯乙腈，采用梯度洗脱：0 min 50%B，4 min 50%B,12 min 80%B,16 min 80%B,16.1 min 50%B,20 min 50%B，流速1 mL/min。进样量为20 μL，柱温40 ℃。

采用电喷雾(ESI)离子源，负离子扫描模式，选择反应监测(SRM)模式下选择离子对m/z407→379进行测定。毛细管温度350 ℃，雾化氮气压力300 kPa，辅助气压力35 kPa，喷雾电压3.5 kV，CID氩气0.2 Pa，碰撞解离能量：45 eV。

2.3 溶液配制

2.3.1 对照品溶液 精密称取杂质Ⅰ对照品约15 mg，置100 mL量瓶中，加稀释剂纯甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取1 mL，置于100 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，配制成质量浓度为1.5 μg/mL对照品储备液；精密量取5 mL，置于10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀；精密量取1 mL，置于10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，配成质量浓度为75 ng/mL的对照品溶液。

2.3.2 供试品溶液 精密称取依卡倍特钠供试品约1 g，置10 mL量瓶中，用甲醇振摇并超声使溶解并稀释至刻度，配制成质量浓度为100 mg/mL的依卡倍特钠供试品溶液。

2.4 方法学验证

2.4.1 专属性 分别取稀释剂纯甲醇按，75 ng/mL的杂质Ⅰ对照品溶液和100 mg/mL的依卡倍特钠供试品溶液按上述条件进行分析，并记录峰面积。图3结果显示，杂质Ⅰ的保留时间为12.33 min，而主成分依卡倍特钠和稀释剂甲醇对其检测均没有干扰。

Figure3 Characteristic LC-MS/MS chromatograms of (A) blank,(B) Imp-I and (C) ecabet sodium

2.4.2 线性试验和定量限(LOQ) 取1.5 μg/mL对照品储备液，逐级稀释成质量浓度为150,100,75,50,25,4 ng/mL的标准溶液，按照上述条件进样分析，并记录峰面积。以杂质Ⅰ的峰面积对质量浓度进行线性回归，线性方程为：y=543.57x+853.48，r=0.999 0。结果表明杂质Ⅰ在质量浓度4～150 ng/mL范围内线性良好，线性低点(定量限)为4 ng/mL。

2.4.3 进样精密度 取75 ng/mL的杂质Ⅰ对照品溶液20 μL进样分析，同一份溶液连续进样6针，记录峰面积，计算RSD为1.75%。

2.4.4 重复性 平行配制75 ng/mL的杂质Ⅰ对照品溶液6份，分别取20 μL进样分析，记录峰面积，计算RSD为2.54%。

2.4.5 加样回收率 精密称定空白依卡倍特钠供试品约1 g共6份，置于10 mL量瓶中，分别加入500，750和1 000 ng/mL杂质Ⅰ溶液1 mL，加入稀释剂定容至刻度，不同质量浓度同法各配制3份。按上述条件进样分析，结果经计算杂质Ⅰ的低、中、高3种质量浓度的平均回收率(n=3，%)分别92.07、106.30和95.56，RSD(n=3，%)分别为2.7、1.3和0.5。

2.4.6 耐用性 按照上述加样回收率试验中质量浓度方法配制加样供试品溶液；在柱温变化为±2 ℃，流速变化为±0.2 mL/min及流动相B初始比例变化变化为±5%的试验条件下进样，分别计算杂质Ⅰ的含量。结果柱温变化(38，40，42 ℃)，杂质Ⅰ含量(×10-4%)分别为0.83、0.80、0.84；流速变化(0.8，1.0，1.2mL/min)，杂质Ⅰ含量(×10-4%)分别为0.82、0.80、0.83；流动相B初始比例变化(45%，50%，55%)，杂质Ⅰ含量(×10-4%)分别为0.78、0.80、0.86。结果表明，杂质Ⅰ含量变化在±0.1×10-4%内，表明本法对柱温、流速、流动相B初始比例变化的耐用性较好。

2.5 样品测定

采用本文方法对6批样品(批号：CPC-055-1702001、CPC-055-1702002、CPC-055-1702003、ZJT-161-1702001、ZJT-161-1702002、ZJT-161-1702003)进行杂质Ⅰ含量测定，按外标法计算杂质Ⅰ含量。结果显示6批样品中均未检出杂质Ⅰ。

3 结 论

杂质Ⅰ为有机酯类，在正负离子模式下均有响应。但由于其在正离子模式下很难裂解，而负离子模式下易于裂解且碎片稳定，因而最终选择了负离子检测模式。离子对的选择参考了文献方法[14]，文献中用于依卡倍特钠定量的离子为m/z379[M-H]-。依卡倍特钠母核的准分子离子m/z379[M-H]-，也正好是杂质Ⅰ最容易产生的碎片之一(酯键发生断裂)。离子对m/z407→379在碰撞能改变的条件下能够稳定出现，因而最后选择了这一离子对作为杂质Ⅰ定量的指标。质谱的其他参数对于结果影响较小，因此采用了常用的默认设置值。

本文合成了依卡倍特钠原料药中潜在遗传毒性杂质依卡倍特磺酸乙酯，并对其进行了结构确证。同时建立了一种快速灵敏专属性良好的高效液相-串联质谱分析方法，可以准确地对依卡倍特钠商业样本中遗传毒性杂质进行定量分析，且定量限远低于杂质限度要求。该方法为依卡倍特钠原料药的质量(特别是遗传毒性杂质)的控制提供了新的思路，未来也可以在此基础上继续研究依卡倍特钠中其他潜在的遗传毒性杂质。

参 考 文 献

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