3种蜂王上颚腺信息素对中蜂雄蜂吸引效果的研究

杨 乐，江武军，史晶亮，何旭江，曾志将

(江西农业大学 蜜蜂研究所，江西 南昌 330045)

蜜蜂是一种真社会性昆虫，拥有一套完善、精细的语言通讯系统，是群体与个体能够正常生长、发育与繁衍的重要保证。化学信息素对蜜蜂尤为重要，常见的蜜蜂信息素有蜂王信息素、工蜂信息素、雄蜂信息素和蜜蜂子脾信息素[1]。其中蜂王上颚腺信息素又称蜂王物质[2]。蜂王上颚腺信息素由蜜蜂蜂王上颚腺产生，可以调控工蜂行为、提高工蜂采集积极性、抑制工蜂卵巢发育，同时也是性引诱剂，诱使雄蜂追踪和发情[3]。

蜂王上颚腺信息素的研究经历了一个漫长的过程。1954年Butler预测工蜂能从蜂王体表获得一种“蜂王物质”，并通过工蜂间的相互饲喂行为传递这种蜂王物质，进而达到控制蜂群的目的。1957年他第一次从蜂王头部成功提取到蜂王物质，随后又证明了蜂王物质是通过蜂王上颚腺产生的，因此称为蜂王上颚腺信息素。20世纪60年代，人们先后从蜂王上颚腺信息素中鉴定并分离出反式-9-氧代-2-癸烯酸(9-ODA)和反式-9-羟基-2-癸烯酸(-9-HDA)。1992年Winston和Slessor[4]在西方蜜蜂蜂王上颚腺信息素中又鉴定出另外3种成分：顺式-9-羟基-2-癸烯酸(+9-HDA)、对羟基苯甲酸甲酯(HOB)以及4-羟基-3-甲氧苯基乙醇(HVA)。1997年Plettner等[5]发现东方蜜蜂蜂王上颚腺信息素中只含有4种成分：9-ODA、+9-HDA、-9-HDA和HOB，不含HVA。2003年Keeling等[6]又从西方蜜蜂蜂王上颚腺信息素中鉴定出另外4种新成分：松柏醇(CA)、甲基油酸盐(MO)、十六烷-1-醇(PA)和亚麻酸(LEA)。这些信息素总称为“蜂王上颚腺信息素”或“蜂王物质”。近年来研究发现，蜂王上颚腺信息素最初作为性信息素吸引雄蜂交尾，随着不断的进化，也具有了调节蜂群内工蜂社会行为的作用[7-8]。

雄蜂的主要作用就是与蜂王交配[9]。在晴朗无风的午后，性成熟雄蜂开始进行婚飞，每次平均持续大约25～32 min。雄蜂婚飞的一个特征是成百上千只雄蜂聚集在一起，形成“雄蜂云”，也叫雄蜂聚集区，多个蜂群的雄蜂会聚集在雄蜂聚集区与蜂王进行交尾[1]。通过对蜂王释放的蜂王上颚腺信息素的感知，雄蜂可以快速找到并追逐蜂王，完成交配[10]。1993年Loper等[11]使用雷达系统探测到9-ODA能吸引到800 m以外的雄蜂，充分显示了蜂王上颚腺信息素对雄蜂极强的吸引效果。

上述的蜂王上颚腺信息素对雄蜂的吸引效应主要集中在西方蜜蜂上，在中华蜜蜂方面鲜有研究报道。中华蜜蜂是我国的重要蜂种，对我国农业生产和生态平衡起着重要作用。自西方蜜蜂引进我国之后，中华蜜蜂的数量显著下降。其中原因之一即是西方蜜蜂对中华蜜蜂处女王交尾行为的干扰。2种蜜蜂蜂王上颚腺信息素成分相近[12]，且他们的处女王婚飞时间和雄蜂出游时间基本一致。因此当中华蜜蜂处女王婚飞时，能吸引大量西方蜜蜂雄蜂与其接触甚至会出现抱对的“交尾行为”(无效交尾)，这使得中华蜜蜂处女王交尾成功率大大下降[13]。本研究从生物学角度出发，并利用行为学观测方法研究不同浓度的3种蜂王上颚腺信息素成分对中华蜜蜂巢门口以及巢脾上雄蜂的吸引力，以期为西方蜜蜂雄蜂干扰中蜂蜂王交尾现象提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试蜜蜂

试验所用雄蜂取自江西农业大学蜜蜂研究所饲养的健康中华蜜蜂(Apisceranacerana)。

1.2 主要试剂

9-ODA、HOB、HVA(纯度均>95%)购自长沙奥百斯特科技有限公司；蜂蜡巢础购自上饶市精益蜂具有限公司；二氯甲烷购自天津市瑞金特化学品有限公司；滤纸购自杭州特种纸业有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 实验准备 参照谭垦等[14]的试验方法，利用二氯甲烷将9-ODA、HOB、HVA均稀释为1 μg/μL、10 μg/μL、100 μg/μL。稀释后的蜂王上颚腺信息素溶液装入棕色样品瓶内，并用密封带封闭瓶口。

将蜂蜡巢础(41 cm×19.5 cm)装入有机玻璃盒(41 cm×19.5 cm)内，用圆规在巢础最中心位置画出1个直径为4 cm的圆作为蜜蜂放置区。在巢础2端1/4的位置分别用昆虫钉固定2片滤纸(2 cm×0.8 cm)作为对照组和试验组。试验示意图见图1。为避免蜂蜡巢础中挥发性物质的干扰，本试验所用到的蜂蜡巢础均已在室温放置1年以上。

1.3.2 样品采集 根据雄蜂的出游飞行习惯[15]，在晴朗无风的09:30—11:30进行巢脾上雄蜂的试验，小心在巢脾上抓取行动敏捷、腹部坚实的中蜂雄蜂；14:30—16:30进行巢门口雄蜂的试验，在巢门口抓取飞行归巢的中蜂雄蜂。每次抓捕30只作为1组，小心放于烧杯内防止其逃跑。

图1 实验所用蜂蜡巢础示意图Fig.1 The picture of the beeswax foundation used in the expressions

1.3.3 3种不同浓度的蜂王上颚腺信息素对雄蜂的吸引效果 打开有机玻璃盒，用移液枪分别吸取1 μL蜂王上颚腺信息素溶液和二氯甲烷加入试验组和对照组。使用CO2将蜜蜂简单麻醉5 s，立即放于蜜蜂放置区，随后关闭有机玻璃盒。待蜜蜂苏醒后，开始数5 min内雄蜂接触试验组和对照组滤纸的次数。为了防止偏向性，每个实验之间都交换对照组和试验组，每交换1次作为1个实验重复。最后将(2次雄蜂接触试验组滤纸的次数-2次雄蜂接触对照组滤纸的次数)的结果记录下来。每个实验用3群中蜂雄蜂做3次重复来测试1种成分的1个浓度。每次试验结束都需要更换蜂蜡巢础和滤纸条，并重新滴加蜂王上颚腺信息素溶液。

1.3.4 数据统计分析 采用StatView 5.01软件对各样品进行显著性差异分析(P<0.05，LSD多重比较)，并通过GraphPad Prism5.2软件作图。

2 结果与分析

2.1 巢门口中蜂雄蜂对不同浓度9-ODA的选择

结果如图2所示，巢门口中蜂雄蜂对于10 μg/μL组的选择显著高于1 μg/μL组(P<0.05)；100 μg/μL组与其余2组的差异均不显著(P>0.05)。

图2 巢门口雄蜂对不同浓度9-ODA的选择次数Fig.2 The choice times of drones captured at hive entrance to the different doses of 9-ODA

图3 巢脾上雄蜂对不同浓度9-ODA的选择次数Fig.3 The choice times of drones captured at frames in hive to the different doses of 9-ODA

2.2 巢脾上中蜂雄蜂对不同浓度9-ODA的选择

结果如图3所示，巢脾上中蜂雄蜂对不同浓度9-ODA的选择差异均不显著(P>0.05)。

2.3 巢门口中蜂雄蜂对不同浓度HOB的选择

结果如图4所示，巢门口中蜂雄蜂对于1 μg/μL组的选择次数显著高于10 μg/μL组和100 μg/μL组(P<0.05)，但10 μg/μL组和100 μg/μL组的选择差异不显著(P>0.05)。

2.4 巢脾上中蜂雄蜂对不同浓度HOB的选择

结果如图5所示，巢脾上中蜂雄蜂对不同浓度HOB的选择差异均不显著(P>0.05)。

图4 巢门口雄蜂对不同浓度HOB的选择次数Fig.4 The choice times of drones captured at hive entrance to the different doses of HOB

图5 巢脾上雄蜂对不同浓度HOB的选择次数Fig.5 The choice times of drones captured at frames in hive to the different doses of HOB

2.5 巢门口中蜂雄蜂对不同浓度HVA的选择

结果如图6所示，中蜂雄蜂对于10 μg/μL组和100 μg/μL组HVA的选择显著高于1 μg/μL组(P<0.05)，但10 μg/μL组与100 μg/μL组的选择差异不显著(P>0.05)。

2.6 巢脾上中蜂雄蜂对不同浓度HVA的选择

结果如图7所示，巢脾上中蜂雄蜂对不同浓度HVA的选择差异均不显著(P>0.05)

图6 巢门口雄蜂对不同浓度HVA的选择次数Fig.6 The choice times of drones captured at hive entrance to the different doses of HVA

图7 巢脾上雄蜂对不同浓度HVA的选择次数Fig.7 The choice times of drones captured at frames in hive to the different doses of HVA

3 讨 论

9-ODA是蜂王上颚腺信息素的主要成分，且是多种成分中唯一1种长距离性信息素[16]。本研究发现10 μg/μL的9-ODA对巢门口雄蜂的吸引力显著高于1 μg/μL组(P<0.05)。前人研究证明0.1当量浓度的9-ODA足以吸引大量西方蜜蜂雄蜂[17]。0.1当量浓度的9-ODA相当于18.4 μg/μL，这与本研究的结果基本一致。

Slessor等[18]发现HOB能作为性引诱剂，引诱西方蜜蜂雄蜂与处女王交尾。本研究发现1 μg/μL的HOB对于巢门口中蜂雄蜂的吸引力显著高于10 μg/μL组和100 μg/μL组，表明HOB对于中蜂雄蜂同样具有吸引力。另外，有研究发现在中蜂蜂王体内HOB的含量低于9-ODA和9-HDA[19]，且Plettner等[20]发现处女王体内HOB含量低于产卵蜂王。笔者推测高浓度HOB可能对中蜂雄蜂的吸引存在抑制作用。

HVA对西方蜜蜂雄蜂具有吸引力[21]。由于中蜂蜂王上颚腺信息素中不含HVA，所以HVA对中蜂雄蜂的作用没有研究报道。本研究发现10 μg/μL和100 μg/μL的HVA对巢门口雄蜂的吸引力显著高于1 μg/μL的HVA，表明HVA对中蜂雄蜂也存在吸引作用，且随浓度升高吸引力逐渐增强，但过高浓度的HVA并不能增强其对雄蜂的吸引力。

本研究发现不同浓度的9-ODA、HOB、HVA对于巢脾上雄蜂的吸引力均差异均不显著。巢门口抓取的雄蜂均为婚飞后返巢的雄蜂，而在巢脾上的雄蜂并未经过出游飞行。有研究发现处女王经过飞行行为会影响其基因表达变化[22-23]，笔者推测雄蜂的飞行行为(婚飞或试飞)也可能影响其基因表达或生理变化，进而提高了其对蜂王上颚腺信息素(9-ODA、HOB、HVA)的选择效果。另外，处女王在婚飞过程中才与性成熟雄蜂发生交尾行为，而在巢脾上并不吸引雄蜂[1]。这与处女蜂王对群内巢脾上雄蜂无吸引效果一致。

谭垦等[14]证明了西方蜜蜂工蜂对于蜂王上颚腺信息素主要成分的敏感性比中蜂工蜂更强，但到目前还没有人系统比较过蜂王上颚腺信息素主要成分对中蜂雄蜂和西方蜜蜂雄蜂的选择行为。本研究证明了9-ODA、HOB以及HVA对飞行归巢中蜂雄蜂均存在吸引作用，同时推测中蜂雄蜂的飞行行为能增强其对蜂王上颚腺信息素的感知力，但有关分子机理还有待于进一步研究。

本研究还发现：高浓度雌性素有抑制雄蜂对蜂王吸引力趋向，这种现象是否与蜂王不在蜂群内与雄蜂交配的生物学特性相关，也有待于进一步探讨。

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