丁酸对瘤胃上皮细胞生长和凋亡的影响

彭志鹏，罗 丹，许 超，熊小文，温庆琪，瞿明仁，欧阳克蕙*

(1.江西农业大学 江西省动物营养重点实验室/营养饲料开发工程研究中心，江西 南昌 330045；2.上海美农生物科技股份有限公司，上海 201800)

丁酸是瘤胃微生物产生的一种短链脂肪酸，是反刍动物的重要能量来源[1]。但当反刍动物采食高精料日粮时，丁酸浓度可能会上升到正常情况下的2～3倍[2-3]，诱导亚急性瘤胃酸中毒的发生[4]，给现代反刍动物生产带来严重影响。许多研究显示，丁酸对维持和保护上皮屏障结构和功能有益，能促进上皮细胞的增殖[5-6]。也有研究显示，过高浓度的丁酸反而会促进细胞凋亡[7-8]。反刍动物发生瘤胃酸中毒情况下，往往造成瘤胃上皮屏障结构破损和功能丧失[9-10]，这是否与瘤胃丁酸浓度过高引起的瘤胃上皮细胞凋亡有关尚不明确。本试验通过体外细胞培养技术，研究丁酸对瘤胃上皮细胞生长及凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料

DMEM培养基、胎牛血清、青链霉素、ITS、丁酸；DMSO、MTT、Tunel试剂盒、DNA ladder试剂盒、Annexin-V/PI试剂盒；全自动酶标仪、荧光显微镜、流式细胞仪。

1.2 试验方法

瘤胃上皮细胞原代培养：试验动物为15日龄湖羊，颈动脉放血处死，剪取瘤胃组织用PBS冲洗干净并用完全培养基带回实验室超净工作台中，钝性分离瘤胃上皮，剪碎后用胶原酶和胰蛋白酶进行消化处理，收集细胞悬液接种于含10%胎牛血清、100 EU/mL青链霉素、1×ITS的DMEM培养基中，于5% CO2、37 ℃的培养箱中培养，30 min后将悬液换瓶培养，重复1次。

待培养的瘤胃上皮原代细胞长满约80%～90%，用胰蛋白酶消化5 min，呈单细胞悬液，调整细胞密度为5×103接种于96孔板中培养。培养24 h贴壁后，每孔加培养液100 μL，设8个处理，每个处理6个重复，在培养液中分别添加0，20，40，60，80，100，120，140 mmol/L的丁酸，调节pH至7.4。于5% CO2，37 ℃培养箱中培养，分别于4，6，8，10 h后用于检测各组细胞活力。

根据相对细胞活力(细胞相对活力为70%左右)筛选最适宜的丁酸处理设为丁酸组(普通培养基+适宜浓度丁酸)，与对照组(普通培养基)，采用荧光标记法、电泳法、流式细胞术检测细胞凋亡情况。

1.3 测定项目和方法

1.3.1 瘤胃上皮细胞活力的检测 采用MTT法检测瘤胃上皮细胞的细胞活力。将培养物小心地吸去上清液弃去，用PBS冲洗2～3遍，加普通培养基120 μL(含20 μL 5 mg/mL MTT溶液)，继续培养4 h，弃上清液，再每孔加入150 μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪上分析，OD490nm处测量各孔的吸光值。将每个时间段对照组细胞活力定义为100%，试验组相对细胞活力根据下列公式计算：

相对细胞活力(%)=OD试验组/OD对照组×100%

(1)

1.3.2 细胞凋亡检测 (1)荧光标记法。原代细胞长满约80%～90%，消化离心去上清，接种于6孔板加玻璃盖片进行爬片培养，铺层至80%～90%时，添加丁酸培养至细胞活力为70%左右，培养好的细胞用4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗2 min×3，3%双氧水室温处理10 min，PBS洗2 min×3，Proteinase K 37 ℃消化30 s，PBS洗2 min×3，加标记缓冲液于湿盒中37 ℃标记2 h，PBS洗2 min×3，加封闭液30 min，生物素化抗地高辛抗体于湿盒中37 ℃ 30 min，PBS洗2 min×3，SABC-FITC 37 ℃ 30 min，PBS洗5 min×4，DAPI轻度复染30 s，PBS洗5 min×3，抗荧光衰减封片剂封片，分别用490 nm和360 nm激发光照射并在荧光显微镜观察。阴性对照中用PBS替换DIG-dUTP。结果判定：细胞核中有黄绿色颗粒者为阳性细胞，即凋亡细胞。

(2)电泳法。取对数生长期的瘤胃上皮细胞接种于25 cm2培养瓶中，与丁酸共培养至细胞活力为70%左右。培养好的细胞，胰蛋白酶消化收集细胞，按DNA ladder试剂盒说明书进行操作。电泳后观察细胞核酸变化。

(3)流式细胞术。取对数生长期的瘤胃上皮细胞接种于6孔板中，与丁酸共培养至细胞活力为70%左右，将细胞上层培养液去除，PBS洗涤2次，用胰蛋白酶消化细胞并终止消化，1 000 g离心5 min，PBS清洗1次，用PBS重悬细胞。制成细胞悬液，取1×106重悬的细胞离心后，加入500 μL结合液轻轻重悬。再加入5 μL Annexin V-FITC，轻轻混匀，再加入5 μL碘化丙啶，轻轻混匀。 室温避光孵育10 min。随即进行流式细胞仪检测，激发光波长用488 nm，用一波长为515 nm的通带滤器检测FITC荧光，另一波长大于560 nm的滤器检测PI。结果判定：Annexin和PI双染阴性为正常细胞；Annexin阳性，PI阴性为早期凋亡细胞；Annexin和PI双染阳性为晚期凋亡细胞；Annexin阴性，PI阳性为坏死细胞。早期凋亡和晚期凋亡的细胞统计为凋亡细胞。细胞凋亡指数根据下列公式计算：

细胞凋亡指数(PI)=凋亡细胞数/检测的细胞总数×100%

(2)

1.4 统计分析

采用SPSS 17.0方差分析程序对试验数据统计分析。数据分析采用独立样本单因素分析(One-way ANOVA)和多重比较(Duncan’s)。数据用平均值±标准差表示。P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果分析

2.1 不同浓度丁酸对瘤胃上皮细胞活力的影响

MTT法检测各组和各时间点的相对细胞活力，结果见表1。结果显示：各时间点细胞活力随丁酸浓度的增加均呈现先上升后下降趋势。20，40 mmol/L丁酸处理组在各培养时间点与对照组差异均不显著，60～140 mmol/L丁酸处理组均显著低于对照组。

表1 丁酸对瘤胃上皮相对细胞活力的影响Tab.1 Effects of butyrate on the relative viability of ruminal epithelial cell %

同列之间比较，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同
Different capital letters in same column mean significant difference at the 0.01 level,and different small letters indicate significant difference at the 0.05 level.The same as bellow

随着培养时间的延长，20～40 mmol/L丁酸处理组细胞活力呈现逐渐提高的趋势，其中20 mmol/L丁酸处理组在各时间点均高于对照组(P>0.05)，40 mmol/L丁酸组在培养4～6 h时降低细胞活力(P>0.05)，在培养8～10 h时提高细胞活力(P>0.05)。随着培养时间的延长，60～120 mmol/L丁酸处理组显示细胞活力随时间延长先下降后上升，其中60 mmol/L丁酸处理组在培养10 h处提高细胞活力(P>0.05)，其他各处理组均降低细胞活力，除80 mmol/L丁酸组10 h处差异不显著(P>0.01)外，其他各组均达到了极显著的差异(P<0.01)。120 mmol/L、140 mmol/L丁酸处理组显示细胞活力最低，且两组间比较差异不显著(P>0.05)。

2.2 免疫荧光法检测结果

根据上一结果，选择较温和的条件(细胞相对活力70%左右[11])来观察细胞凋亡情况，具体条件为120 mmol/L丁酸，培养6 h。细胞TUNEL染色检测结果见图1。由图1可见，丁酸组的上皮细胞出现大面积脱落，且细胞“群落”边缘多为黄绿色标记的细胞；对照组中只有少部分细胞被标记为黄绿色，未有细胞脱落现象。

A：对照组；B：120 mmol/L丁酸组A:Control group;B:120 mmol/L Butyrate group图1 荧光标记凋亡细胞的观察Fig.1 Apoptotic cell marked by fluorescent

M:Marker;A：对照组;B：120 mmol/L丁酸组M:Marker;A:Control group;B:120 mmol/L Butyrate group图2 电泳法对瘤胃上皮细胞DNA Ladder的检测Fig.2 DNA ladder examination of ruminal epithelial cell by electrophoresis analysis

2.3 DNA ladder电泳检测结果

DNA ladder电泳检测结果见图2。由图2可见，120 mmol/L丁酸作用6 h，可见100～500 bp处呈现条带拖尾现象；对照组在100～500 bp处未见此现象。

2.4 流式细胞仪检测结果

流式细胞仪检测结果见图3和表2。结果显示：120 mmol/L丁酸处理6 h后，相比于对照组的74.2%正常细胞、9%早期凋亡细胞和15.1%晚期凋亡细胞，丁酸组变为69.5%正常细胞，7.8%早期凋亡细胞和20.6%晚期凋亡细胞。可见，丁酸组减少了早期凋亡的细胞数量，增加了晚期凋亡的细胞数量，其总凋亡指数(28.4%)与对照组(24.1%)比较有显著差异(P<0.05)。

A：对照组；B：120 mmol/L丁酸组A:Control group;B:120 mmol/L Butyrate group图3 丁酸处理对瘤胃上皮细胞凋亡指数的影响Fig.3 Effects of butyrate on apoptotic index of ruminal epithelial cell

表2 丁酸处理对瘤胃上皮细胞凋亡的影响Tab.2 Effects of butyrate on apoptotic of ruminal epithelial cells

3 讨论结论

本研究发现，低浓度的丁酸能促进瘤胃上皮细胞生长，而浓度过高的丁酸会抑制细胞生长，这种抑制作用可能和高浓度丁酸促进了瘤胃上皮细胞凋亡有关。许多研究表明，短链脂肪酸丁酸可供给细胞能量，是一种有效的肠道保健剂，能促进胃肠道上皮细胞增殖[6-7]。Guilloteau等[12]用3 g/kg丁酸钠替代黄霉素，发现丁酸钠可以提高胃和结肠中热休克蛋白HSP27和HSP70浓度，保护胃肠上皮细胞，促进犊牛胃肠功能成熟。胡卫[13]研究发现，体内肠腔正常浓度(10 mmol/L)的丁酸钠，在体外亦有抑制大鼠结肠上皮细胞凋亡的作用，从而有助于治疗溃疡性结肠炎。但Siavoshian[14]研究表明，丁酸浓度大于8 mmol/L时完全抑制人肠道上皮细胞的生长。这可能是由于不同细胞对丁酸的耐受程度不同所致。丁酸是瘤胃微生物发酵的产物之一，是反刍动物生长的重要能源[1]。正常情况下，瘤胃内丁酸浓度并不高。但在发生瘤胃酸中毒情况下，丁酸在瘤胃内迅速累积，对瘤胃粘膜屏障的结构完整造成破坏[9]。在黄晓忠[15]的研究中，2 mmol/L丁酸钠能促进肠上皮屏障功能，而中、高浓度丁酸钠(5～8 mmol/L)则刺激p38MAPK的表达，诱导大量Caco-2细胞凋亡，破坏细胞肠屏障功能。Pant[8]也证实，5 mmol/L的丁酸可抑制组蛋白去乙酰化酶SIRT-1的表达，增强活性氧的产生，从而增加肝细胞凋亡，抑制肝细胞的生长和增殖。这与本研究结果相似。

丁酸对瘤胃上皮细胞生长有影响且存在剂量依赖性。低浓度丁酸(20 mmol/L)对细胞生长有益，高浓度丁酸(40～140 mmol/L)对细胞生长有抑制作用。120 mmol/L丁酸培养6 h后诱导了瘤胃上皮细胞发生凋亡。

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