乳腺癌组织中人乳腺球蛋白的表达水平及其与乳腺癌发生和发展的关系

王 刚，廖翠屏，刘 敏，温亚楠

(四川省成都市温江区妇幼保健院检验科 611130)

人乳腺球蛋白是由乳腺癌上皮细胞克隆而来的乳腺癌相关蛋白，其在约85%的乳腺癌中呈过高表达，但并不表达于其他癌组织，因此有较高的乳腺癌组织特异性[1-2]。本研究选取乳腺癌组织、癌旁正常组织及乳腺良性病变组织标本，通过免疫组化方法、组织微阵列技术及反转录聚合酶链反应(RT-PCR)对上述组织标本中人乳腺球蛋白及其mRNA表达水平进行检测，分析其表达水平与乳腺癌临床病理特征的相关性，分析其与乳腺癌发生和发展的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集本院2015年1月至2017年8月乳腺癌组织(A组)、癌旁正常组织(B组)及乳腺良性病变组织(C组)标本各40例。A组患者年龄24～65岁，平均(49.95±6.57)岁；B组患者年龄21～68岁，平均(51.06±7.47)岁；C组患者年龄22～69岁，平均(50.63±7.48)岁。3组的年龄、病理分型等一般资料比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。40例乳腺癌的病理分型：浸润型35例，非浸润型5例；TNM分期：Ⅰ期11例，Ⅱ期21例，Ⅲ期7例，Ⅳ期1例；发生腋窝淋巴结转移24例。本研究内容已通过本院医学伦理委员会批准。

1.2方法

1.2.1RT-PCR引物设计 按照人乳腺球蛋白mRNA序列，通过Primer Premier 5.0软件对PCR引物上、下游序列进行设计，其中人乳腺球蛋白mRNA引物序列长度为320 bp，β-actin序列长度为490 bp；引物由金斯瑞生物科技有限公司合成和纯化。

1.2.2RT-PCR检测 采用Trizol提取液一步法提取细胞总RNA。并通过一步法进行RT-PCR操作，严格按照PCR试剂盒(购自上海吉玛制药技术有限公司)说明书进行检测。反应条件：94 ℃预变性5 min，以相同温度进行变性30 s，58 ℃退火40 s，共进行40个循环；循环结束后，在62 ℃延伸3 min，72 ℃总延伸5 min；反转录合成cDNA(Quit eDNA第一链合成试剂盒)，将β-actin作为内参照。根据PCR扩增仪(购自美国ABI公司，型号2720型)及SYBRGreen试剂盒说明书完成操作，其反应条件为：94 ℃预变性5 min，以相同温度变性30 s，58 ℃退火30 s，共进行40个循环；循环结束后，在62 ℃延伸60 s，68 ℃总延伸3 min。

1.2.3免疫组化检测 全部标本均经10%中性甲醛进行固定处理，并用石蜡进行包埋，制成微阵列芯片(孔径3 mm，含40个组织芯)，4 mm切片；选用2张用于免疫组织化学染色，另选1张用于HE染色；通过磷酸盐缓冲液代替一抗作为阴性对照，严格按试剂盒说明书完成相应操作。

1.3免疫组化结果判读标准[3]人乳腺球蛋白阳性定义：胞浆、细胞膜存在棕色颗粒，反之为阴性。随机选取10个高倍视野，观察阳性细胞的染色强度，0分：无显色；1分：淡黄色；2分：棕黄色；3分：棕褐色。并对阳性细胞在总细胞数所占百分比进行评分，阴性：0分；阳性细胞在25%及以下：1分；阳性细胞>25%～50%：2分；阳性细胞>50%～75%：3分；阳性细胞>75%～100%：4分。将阳性细胞的染色强度及其百分比得分相加，其中0～3分为阴性，>3～7分为阳性。

2 结 果

2.13组人乳腺球蛋白阳性结果及其mRNA表达水平比较 见表1。A组人乳腺球蛋白阳性率明显高于B、C组，且其mRNA表达水平也明显高于B、C组，差异均有统计学意义(P<0.05)；而B组与C组mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 3组人乳腺球蛋白阳性结果及其mRNA表达水平比较

注：与B、C组比较，*P<0.05

2.2乳腺癌组织中人乳腺球蛋白阳性率与临床病理特征的相关性 见表2。乳腺癌组织中人乳腺球蛋白的表达与组织学分级、淋巴结转移及雌激素受体(ER)水平均密切相关(P<0.05)，其中组织学分级为Ⅱ～Ⅲ级、发生腋窝淋巴结转移及ER阳性者人乳腺球蛋白的阳性率明显高于组织学分级为Ⅰ级、无淋巴结转移及ER阴性者；而人乳腺球蛋白阳性率与病理类型、TNM分期、肿瘤大小及孕激素受体(PR)均无明显相关性(P>0.05)。

表2 乳腺癌组织中人乳腺球蛋白阳性率与临床病理特征的相关性[n(%)]

续表2 乳腺癌组织中人乳腺球蛋白阳性率与临床病理特征的相关性[n(%)]

2.3多因素Logistic回归分析结果 见表3。将乳腺癌组织中人乳腺球蛋白作为因变量，临床病理特征各项指标作为自变量进行多因素Logistic回归分析。提示乳腺癌组织中人乳腺球蛋白的表达与组织学分级、PR及ER水平均存在明显关系(P<0.05)。

表3 多因素Logistic回归分析结果

3 讨 论

远处转移是引起乳腺癌患者死亡的主要因素之一。有研究报道，早期乳腺癌不排除远处转移的可能性[4-5]。近年来，肿瘤标志物广泛应用于肿瘤的诊断、疗效及预后评价中，并且也广泛用于高危人群的随访研究中。其中糖类抗原153(CA153)、癌胚抗原(CEA)及CA125均为目前临床常用的肿瘤标志物，但因其灵敏度和组织脏器特异度通常低于25%，因此并非是诊断乳腺癌和疾病复发、转移的确切指标[6-8]。所以，探索一种或多种更为确切有效的乳腺癌特异性标志物对提高疾病的准确率及转移判断显得尤为重要。人乳腺球蛋白是经93个氨基酸序列组合而成，其基因处于染色体11q13。既往有研究指出，人乳腺球蛋白有理想的乳腺癌组织特异度，可作为诊断乳腺癌的重要指标[9]。

本研究采用RT-PCR和免疫组织化学法对乳腺癌组织、癌旁正常组织及乳腺良性病变组织中人乳腺球蛋白及其mRNA表达情况进行检测发现，A组人乳腺球蛋白阳性率明显高于B、C组，并且其mRNA表达水平也明显高于B、C组；但B组与C组及其mRNA表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)，与文献[10-11]研究报道吻合。本研究结果表明，人乳腺球蛋白及其mRNA在乳腺癌组织中表达较高，在癌旁正常组织的表达较低，而在乳腺良性病变组织中并无表达。此外，本研究发现，乳腺癌组织中人乳腺球蛋白的表达与组织学分级、淋巴结转移及ER均密切相关，其中组织学分级为Ⅱ～Ⅲ级、发生腋窝淋巴结转移及ER阳性者人乳腺球蛋白的阳性率明显高于组织学分级为Ⅰ级、无淋巴结转移及ER阴性者，与文献[12]报道一致；而人乳腺球蛋白阳性率与病理类型、TNM分期、肿瘤大小及PR均无明显相关性。多因素Logistic回归分析发现，乳腺癌组织中人乳腺球蛋白的表达与组织学分级、PR及ER均存在明显关系。本研究结果表明，组织学分级、PR及ER可能是人乳腺球蛋白表达的影响因素，可进一步推断人乳腺球蛋白可能在乳腺癌的发生、发展过程中发挥一定作用，并且随着其表达水平升高，肿瘤分化程度加重，进而导致其恶性程度升高、肿瘤侵袭性提高。所以，人乳腺球蛋白可能是评估乳腺癌肿瘤侵袭能力及恶性程度的重要指标。

目前，有关人乳腺球蛋白的表达水平与乳腺癌ER、PR相关性的看法尚未明确，但有研究指出，乳腺癌组织中人乳腺球蛋白的阳性率与ER并无明显关系，而与PR存在明显关系[13]。另有研究指出，乳腺癌组织中人乳腺球蛋白的阳性率与ER存在明显关系，而与PR并无明显关系[14-15]。本研究结果表明，人乳腺球蛋白阳性率与ER密切相关，而与PR阳性与否并无明显关系；进一步采用多因素Logistic回归分析发现，乳腺癌组织中人乳腺球蛋白的表达与PR及ER均存在明显关系。与上述研究存在争议的原因可能因χ2检验是独立样本量百分率的基因，并不会受混杂因素的影响；而Logistic回归分析作为多变量分析方法之一，是分析二分类观察结果与某些因素间的关系，所以其受混杂因素的干扰较大。并且，雌二醇作为孕酮受体合成的启动因素，PR需在ER存在时才能起到一定作用。所以，单独PR阳性表达可能对人乳腺球蛋白表达的影响较小，故二者并未存在密切联系。但PR与ER同时呈阳性表达时可能起到彼此协同作用而使人乳腺球蛋白表达水平升高、阳性率升高，但有关具体影响机制尚未定论，仍需今后进一步探讨。

综上所述，人乳腺球蛋白在乳腺癌组织中呈高表达，并且其与组织学分级、PR及ER密切相关，其可能参与乳腺癌的发病过程，可作为评估患者肿瘤侵袭能力及恶性程度的重要指标。

[1]LAPEIRE L,DENYS H,COCQUYT V,et al.When fat becomes an ally of the enemy:adipose tissue as collaborator in human breast cancer[J].Horm Mol Biol Clin Investig,2015,23(1):21-38.

[2]侯永强，刘金彪，王新征，等．人乳腺球蛋白在乳腺癌中的表达及临床意义[J]．实用医学杂志，2012，28(9)：1572-1573．

[3]何子平，陈琼驹，欧阳思旗，等．乳腺癌患者中乳腺球蛋白的表达及其临床意义[J]．中国当代医药，2013，20(14)：79-80．

[4]COLDITZ G A,BOHLKE K,BERKEY C S.Breast cancer risk accumulation starts early:prevention must also[J].Breast Cancer Res Treat,2014,145(3):567-579.

[5]胡园园，陈旭，刘佩佩，等．乳腺珠蛋白在乳腺癌中的研究进展[J]．现代肿瘤医学，2017，25(17)：2836-2839．

[6]许建华．乳腺癌前哨淋巴结中hMAM mRNA的检测及其临床意义[J]．中国普通外科杂志，2012，21(11)：1456-1458．

[7]AZAB B N,BHATT V R,VONFROLIO S,et al.Value of the pretreatment albumin to globulin ratio in predicting long-term mortality in breast cancer patients[J].Am J Surg,2013,206(5):764-770.

[8]ROSE D P,GRACHECK P J,VONA-DAVIS L.The interactions of obesity,inflammation and insulin resistance in breast cancer[J].Cancers(Basel),2015,7(4):2147-2168.

[9]SAMAVAT H,KURZER M S.Estrogen metabolism and breast cancer[J].Cancer Lett,2015,356(2):231-243.

[10]左思，杨伟萍，韦长元，等．细胞角蛋白19和人乳腺球蛋白在乳腺癌阴性前哨淋巴结中的表达及临床意义[J]．实用老年医学，2012，26(3)：242-244．

[11]侯永强，刘金彪，王新征，等．人乳腺球蛋白及Ki-67在乳腺癌中的表达及临床意义[J]．河南科技大学学报(医学版)，2012，30(1)：15-17．

[12]CHANG Y W,SINGH K P.Long-term exposure to estrogen enhances chemotherapeutic efficacy potentially through epigenetic mechanism in human breast cancer cells[J].PLoS One,2017,12(3):e0174227.

[13]黄英，刘新兰，厚玉瑾，等．hMAM,VEGF-C 和 VEGF-D 在乳腺癌原发灶及腋淋巴结中的表达[J]．广东医学，2016，37(1)：117-119．

[14]何凡，阮剑，宁晓洁，等．RT-PCR检测人乳腺球蛋白在乳腺癌SLN微转移灶检出率及假阴性作用分析[J]．实用临床医药杂志，2017，21(11)：90-93．

[15]ROSE D P,VONA-DAVIS L.Biochemical and molecular mechanisms for the association between obesity,chronic inflammation,and breast cancer[J].Biofactors,2014,40(1):1-12.