血清CD146表达在结直肠癌早期诊断中的价值及机制*

邱芳华，刘道利，龙华婧△，杨泽填，刘丽芳

(广州市中医医院:1.感染科；2.检验科 510130；3.广州中医药大学 510130)

结直肠癌(CRC)是常见的消化道恶性肿瘤，多年来其发病率在世界范围内高居第3位[1]。在过去20多年，曾经低发病率的亚洲地区也呈暴发式增长[2-3]。近年来，随着我国居民生活方式及饮食结构的转变，我国大肠癌发病率也急剧上升，严重威胁着人民的健康，并带来了沉重的经济负担[4]。早期发现CRC 5年生存率可高达97%，一旦复发或转移，即使选择手术治疗，成功率也降至12%[5]。因此，寻找一种有效诊断标志物有重要的社会意义和临床价值。CD146又称为黑色素瘤细胞黏附分子(MCAM)，最初是在黑色素瘤中发现的跨膜糖蛋白[6]。有研究发现，CD146可在多种实体瘤中促进肿瘤生长、血管生成及转移，可能是基因治疗的一项精准靶点[7]。有研究发现，YAP及CD146在肝癌组织中表达上调,YAP可通过CREB信号通路上调CD146的表达[8]。近年研究发现，YAP在结肠癌中过表达，在癌变进展中起到至关重要的作用[9-11]。因此，本研究推测，过度活化的YAP可能在CRC中上调CD146表达水平；另一方面，CD146作为细胞膜分子，可能分泌或脱落释放入血，是CRC新的血清生物学标志物。本研究首先采用组织标本验证YAP及CD146的表达情况，在CRC细胞株中过表达YAP并检测CD146水平；同时比较对照者、腺瘤及CRC患者血清中CD146水平，以明确其临床诊断意义，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集广州市中医医院2014-2017年收治的腺瘤及肠癌组织标本，术后新鲜组织立即放入液氮中保存。其中腺瘤40例(腺瘤组)，Ⅰ期CRC 32例，Ⅱ期CRC 40例，Ⅲ期CRC 46例,Ⅳ期CRC 49例(CRC组)；对照组为健康人群40例。所有CRC诊断均符合《结直肠癌诊疗规范(2015 版)》。采集所有研究对象空腹外周血5 mL，3 000 r/min离心10 min后放-80 ℃保存。

1.2细胞培养及YAP过表达 CRC细胞株HCT-116及HT-29均在含10%胎牛血清的DMEM培养液中进行培养。YAP cDNA片段由Origene(RC231269)购得，并装载于真核表达载体pcDNA3.1(+)中。以pcDNA3.1(+)空载为对照(NC)，pcDNA3.1-YAP为试验组分别转染于CRC细胞HCT-116及HT-29中。转染试剂为lipofectin 2000(Invitrogen)，转染步骤按说明书操作。

1.3蛋白免疫印迹法(WB)检测 总蛋白由蛋白裂解RIPA裂解，BCA试剂盒进行定量。30 μg蛋白上样、电泳、转膜、封闭、4 ℃一抗孵育过夜及常温二抗1 h，最后进行显色。所用抗体YAP(#14074)、CD146(#13475)及GAPDH(#5174)均购自CST。稀释度为1∶1 000。

1.4酶联免疫吸附试验(ELISA) CD146 ELISA试剂盒购自上海抚生生物科技有限公司。ELISA严格按照试剂说明书进行，所用样品用缓冲液稀释(1∶4)，同时制备标准曲线，线性范围为5～70 000 ng/mL。

1.5统计学处理 采用Medcalc 15.6.1软件进行统计分析。检测结果呈非正态分布数据，采用两独立样本非参数检验进行两组间比较(Mann-Whitney检验)，受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析评估曲线下面积(AUC)。χ2检验用于参数间相关性分析。

2 结 果

2.1YAP过表达促进CRC细胞CD146表达 收集11对CRC患者的新鲜标本，对YAP及CD146表达水平进行检测。如图1A所示，YAP及CD146在7例患者(#1～4,#6～7及#10)CRC组织中表达水平明显升高。为了进一步明确YAP对CD146表达的调控作用，本研究在CRC细胞株HCT-116及HT-29中过表达YAP，发现2株细胞过表达YAP后，CD146蛋白表达水平明显升高(图1B)。

注：A为11例CRC组织YAP及CD146的表达；B为YAP在HCT116及HT-29 CRC细胞株中过表达上调CD146;NC为过表达对照空载质粒；N为癌旁组织；T为癌组织

图1 YAP在CRC中过表达并诱导CD146水平上调

2.2血清CD146在健康者、腺瘤及不同阶段肠癌患者中的表达水平 根据上述结果推测，在肠癌患者血清中可能检测出CD146水平。采用ELISA对对照组，腺瘤组，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期CRC患者进行血清CD146水平检测。如图2A所示，CRC患者血清CD146水平明显高于对照组及腺瘤组，差异均有统计学意义(P<0.01)。因为血清癌胚抗原(CEA)是目前CRC经典的肿瘤标志物,以6.565 ng/mL为截断值(40例健康者第95%百分位数)，把上述人群分为CEA阳性组和CEA阴性组。结果表明，在CEA阴性组，除健康者和腺瘤患者外，有相当一部分(31%)CRC患者其血清CD146水平较高，提示血清CD146诊断CRC比CEA有更高的灵敏度(图2B)。诊断指标的灵敏度还表现在肿瘤移除后的变化程度，本研究对上述30例CRC患者进行术后1个月随访，检测其血清CD146及血清CEA水平变化。如图2C所示，血清CD146水平术后较术前明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)，平均相对变化35.72%，CEA术后与术前比较降低不明显，提示CD146作为诊断CRC的敏感度高。

注：A为血清CD146在对照组、腺瘤组及CRC组表达水平；B为血清CEA阴性标本中对照组、腺瘤组及CRC组的CD146水平；C为血清CD146及CEA水平在CRC组患者手术前后变化情况

图2血清CD146在对照组、腺瘤组及CRC组的表达水平

2.3血清CD146与CEA早期诊断CRC的性能比较 见图3。腺瘤组与对照组比较，CD146的AUC为0.646(95%CI：0.531～0.750)，CEA的AUC为0.559(95%CI：0.443～0.670)，2项指标均不能进行有效区分腺瘤患者与对照者。早期CRC患者(Ⅰ期CRC)CD146的AUC=0.831，95%CI：0.724～0.909,较CEA的AUC=0.527,95%CI：0.406～0.646诊断性能更高。所有CRC患者血清CD146的AUC高达0.925，95%CI：0.881～0.957，而CEA的AUC为0.801，95%CI：0.740～0.853。

图3 血清CD146及CEA诊断CRC性能比较

变量血清CD146低水平高水平P年龄(岁)≥6536410.488 6<654842性别女46510.472 5男3832肿瘤部位结肠47520.469 4直肠3731分化程度高/中分化83740.021 3低分化19

续表1 血清CD146水平与临床病理资料的相关性分析(n)

2.4血清CD146水平与临床资料相关性分析 对CD146在CRC患者血清中水平和患者临床资料进行进一步分析，取所有CRC患者血清CD146中位数作为截断值，将CRC患者分为血清CD146低水平组及高水平组，对这两组患者临床及病理资料进行分析(表1)，结果显示，血清CD146水平与肠癌的分化高低、肿瘤细胞浸润程度、远处转移与否及CEA水平高低差异均有统计学意义(P<0.05)。提示血清CD146水平不仅可作为CRC患者的早期诊断标志物，也与上述CRC患者预后的高危因素密切相关，是临床不良结局的预测指标。

3 讨 论

大肠癌在世界范围内发病率、病死率不断上升。随着经济发展和人民生活水平不断提高，以及生活方式、膳食结构的改变，我国大肠癌发病率也呈逐年上升趋势[12]。目前，CRC筛查最为准确的方法为肠镜，然而因其具有侵入性，操作前需进行肠道准备、依从性差等原因并没有被普及。大便潜血检查虽然因其无创、价格低廉等被广泛接受，但仅能检出30%～65%的肠癌，漏诊率高。CEA作为目前较为常用的诊断指标存在特异性差及灵敏度过低等问题[13-15]。因此，临床上急需有效、敏感的标志物尽早对CRC进行诊断，以便早期干预和处理。

CD146是肿瘤细胞表面重要的膜蛋白分子,多项研究表明，CD146在肿瘤中高表达[16-18]。CD146通过直接结合ERM接头蛋白与细胞骨架相连来促进细胞伪足的伸长和细胞运动。CD146-ERM复合物可以结合小G蛋白的抑制分子Rho-GDI激活RhoA，而Rho-PI4P5K通路激活又进一步增强CD146与ERM的结合，参与肿瘤细胞的迁移[19]。 JIANG等[20]研究表明，CD146 与VEGFR-2相互结合，促进体外和体内血管生成。但是否可以作为肠癌的诊断指标，目前相关研究较少。

为明确CD146在CRC中的诊断作用，本研究首先利用WB检测CRC组织及正常组织中CD146的表达水平，结果发现，CD146在8例(共11例)CRC中表达上调，且YAP与CD146均在肠癌组织中高表达，二者具有高度一致性。CRC细胞株HCT116及HT-29在细胞株中过表达YAP后，CD146明显上调，证明CD146表达升高的原因可能与YAP高表达有关，其过表达可引起CD146表达上调。

作为细胞表面膜分子，本课题对CD146是否释放或脱落进入血液循环系统，是否可以成为诊断CRC的新标志物进行了初步研究，结果显示，肠癌患者血清CD146明显高于健康对照组，肠癌组AUC高达0.925，早期肠癌组AUC为0.831，均高于同期的CEA水平。提示CD146与组织中WB检测结果吻合，表明CD146对CRC有较好的诊断意义。

本研究还进行了手术切除后血清CD146水平的追踪，结果提示，在患者术后1个月，血清CD146水平明显下降，而同期CEA水平下降不明显，提示CD146能够反映肿瘤负荷及切除有效性。

CRC分化程度、浸润程度、淋巴结转移及远处转移CRC患者不良预后的高危因素[21]。本研究发现，CRC患者血清CD146高表达与其病理分化、侵袭深度、淋巴结转移及远处器官转移呈正相关，表明血清CD146水平还可作为CRC预后的一个风险因素。

综上所述，本研究结果初步揭示血清CD146有望作为CRC诊断及预后的分子标志物，同时明确CD146的表达与YAP密切相关。由于本研究标本数量有限，后续会进行大样本研究，进一步明确CD146的临床应用价值。

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