加减薯蓣丸对血管性痴呆大鼠海马突触再生和可塑性影响的研究

李红兵 谭子虎

1.湖北中医药大学 武汉 430061 2.贵阳市第一人民医院 3.湖北省中医院

目前我国血管性痴呆（vascular dementia，VD）发病率仅次于阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD），VD患者约占痴呆患者总数的20%[1]。近年来，中医药治疗VD取得了较好效果。基于《金匮要略》薯蓣丸原方化裁而来的加减薯蓣丸（Modified Dioscorea Pills，MDP）具有补肾填精、益气通络、健脾调肝之功，临床上对于非痴呆型血管性认知功能障碍及中风后失语等疾病疗效显著[2-3]。众所周知，突触是神经信息传递与处理过程的中心环节，因此突触的数量及功能状态对认知功能具有决定性作用。笔者所在团队的前期研究证实，MDP可明显促进VD大鼠海马区脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）的mRNA表达[4]，而BDNF可促进突触再生，提高突触可塑性，从而改善VD大鼠智能[5]。为进一步明确MDP对VD大鼠海马区突触的影响，本研究从突触相关蛋白的表达和突触的超微结构的角度进行研究。

1 材料和方法

1.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠40只，8～9周龄，体质量约（300±20）g，购自湖北省预防医学科学院实验动物中心[实验动物生产许可证号：SCXK（鄂）2015-0018]。大鼠喂养于湖北中医药大学动物房，进食及饮水自由，饲料由湖北省预防医学科学院提供。光照/黑暗时间 12/12h，温度（22±2）℃，湿度（60±10）%。

1.2 主要试剂和仪器 MDP由山药、熟地黄、何首乌、全当归、杜仲、川芎、西党参、茯苓、白术、白芍、枸杞、菖蒲、远志、五味子共14味中药组成，均由湖北省中医院制剂室提供，经提纯浓缩制备成含药材1g·mL-1的浓缩汤剂。小鼠抗大鼠微管相关蛋白-2（microtubule associated protein-2，MAP-2）抗体（anti-MAP-2）、小鼠抗大鼠突触素（synaptophysin，SYP）抗体（anti-SYP）及小鼠抗大鼠突触后密度蛋白-95（postsynaptic density protein-95，PSD-95）抗体（anti-PSD-95）均购于武汉三鹰生物技术有限公司（批号分别为：17490-1-AP、17785-1-AP、20665-1-AP)。水迷宫实验设备及软件购于成都泰盟科技公司。Hitachi H-7000FA型透射电镜为日本日立公司产品。

1.3 动物分组及造模方法 适应性喂养1周后，按照随机数字表将大鼠分为手术组28只及假手术组12只。手术组采用改良双血管阻断（2-vessels occlusion，2-VO）法建立大鼠VD模型，具体方法为：大鼠采用异氟烷吸入麻醉后先分离右侧颈总动脉并两端结扎，从结扎中心剪断颈总动脉，分层缝合并以青霉素40万U/只局部注射预防感染，1周后以同样方法处理左侧颈总动脉。假手术组大鼠不结扎及剪断颈总动脉，其余操作步骤同手术组。VD模型造模成功判定：大鼠清醒后反应迟钝，行动迟缓，行走不稳，呈现无目的的旋转运动。2-VO术后1周后进行1次Morris水迷宫定位航行训练，以假手术组大鼠逃避潜伏期的均值为参考值，逃避潜伏期超过参考值20%的大鼠定义为痴呆大鼠。

1.4 干预措施 术后假手术组大鼠死亡1只，手术组死亡5只，存活大鼠均造模成功。将手术组存活大鼠按随机数字表分为药物组12只，模型组11只。2-VO术后1周，药物组以MDP浓缩汤剂灌胃，按黄继汉等[6]的方法，药物剂量换算系数为0.162，药物组大鼠灌胃1mL/100g，1次/d，即相当于成人剂量1.62g/kg·d，共灌胃45d；模型组及假手术组大鼠采用0.9%氯化钠溶液灌胃，剂量、疗程及方法同药物组。

1.5 水迷宫实验检测大鼠行为学改变 常规进行定位航行及空间搜索实验[7]，共进行5d，前4d为定位航行实验，最后1d为空间搜索实验。定位航行实验每天进行2次，从四个不同象限中将大鼠面向池壁放入水中，计算机自动计算每个大鼠的航行距离及逃避潜伏期。如果大鼠在120s内找不到水下的平台，则引导其到平台并停留2min，使其记忆平台与周围环境的关系，逃避潜伏期记为120s。其余则按照实际时间和距离由计算机测算。最后1d则撤除平台，计算大鼠在120s搜索过程中，跨越平台次数、平台所在象限（第一象限）游行时间、游行距离以及总游行距离。

1.6 免疫组化检测突触相关蛋白的表达 各组选择8只大鼠，10%水合氯醛（0.35g·kg-1）腹腔注射麻醉后，固定于解剖板上，剖开腹腔，暴露肝脏和横膈膜，迅速剪开横膈膜，打开胸腔，暴露心脏。将灌注针头从心尖部位经左心室插入升主动脉，剪开右心耳，快速灌入0.9%氯化钠溶液100～150mL，直至体循环血液冲洗干净，灌流液转为清亮。待大鼠尾巴伸直，四肢颤抖停止，观察肝脏逐渐变成白色，再用4%多聚甲醛250mL灌注。40min后断头取脑组织，4%多聚甲醛磷酸缓冲液固定12～24h，常规脱水、浸蜡、包埋，制备海马石蜡切片，经过抗原修复、阻断内源性过氧化物酶后分别添加一抗（anti-MAP-2、anti-SYP及anti-PSD-95），再加入辣根过氧化物酶标记的二抗，DAB显色及Harris苏木素复染。采集图像，每张切片选取3张400倍照片，使用IPP6.0软件进行光密度分析，以平均光密度表示各蛋白表达水平。

1.7 突触超微结构的形态学观察 每组选择3只大鼠，10%水合氯醛（0.35g·kg-1）腹腔注射麻醉后，断头处死，立即快速剥离脑组织，沿视交叉前端作冠状切面，取大鼠左侧大脑海马CA1区组织3块，组织块约1mm3大小，经固定、漂洗、脱水、渗透、包埋后以超薄切片机制作60～80nm切片。铀铅双染色，干燥过夜后透射电镜下观察突触情况。

1.8 统计学分析 采用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析。计量资料以±s表示。两组间比较用t检验，多组间比较用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠行为学改变比较 水迷宫实验最初2d，各组大鼠逃避潜伏期及逃避距离没有统计学差异（P＞0.05）。第3天开始，假手术组大鼠逃避距离及逃避潜伏期与模型组相比下降较多，具有统计学差异（P＜0.05）。第4天药物组大鼠逃避距离及逃避潜伏期下降较快，与假手术组接近，二者与模型组相比均有统计学差异（P＜0.05，P＜0.05）。见表 1、2。在空间搜索实验中，假手术组及药物组大鼠跨越平台次数均多于模型组（P＜0.01，P＜0.05），平台所在象限游行时间及游行距离也多于模型组（P＜0.05，P＜0.01），但 3组大鼠的总游行距离及速度无统计学差异（P＞0.05）。见表3。

表1 各组大鼠逃避距离比较（±s,cm）Tab.1 Comparison of escaping latency among different groups(±s,cm)

表1 各组大鼠逃避距离比较（±s,cm）Tab.1 Comparison of escaping latency among different groups(±s,cm)

注：与模型组相同时点比较，*P＜0.05。Note:Compared with model group at the same time,*P＜0.05.

表2 各组大鼠逃避潜伏期比较（±s,s）Tab.2 Comparison of escaping latency among different groups(±s,s)

表2 各组大鼠逃避潜伏期比较（±s,s）Tab.2 Comparison of escaping latency among different groups(±s,s)

注：与模型组相同时点比较，*P＜0.05。Note:Compared with model group at the same time,*P＜0.05.

表3 各组大鼠空间搜索实验结果比较（±s）Tab.3 Comparison of the parameters of probing test among different groups(±s)

表3 各组大鼠空间搜索实验结果比较（±s）Tab.3 Comparison of the parameters of probing test among different groups(±s)

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。Note:Compared with model group,*P＜0.05,**P＜0.01.

2.2 各组大鼠海马突触相关蛋白表达比较 药物组及假手术组大鼠MAP-2蛋白表达高于模型组，具有统计学差异（P＜0.01，P＜0.05），而且药物组高于假手术组（P＜0.01）。药物组大鼠SYP蛋白表达明显高于模型组及假手术组（P＜0.01，P＜0.01），而且药物组明显高于假手术组（P＜0.01）。药物组及假手术组大鼠PSD-95 蛋白表达明显高于模型组（P＜0.01，P＜0.01），而且药物组高于假手术组（P＜0.01）。见图1、表4。

2.3 各组大鼠突触的超微病理学分析 从电镜图像可以看出，假手术组突触结构完整，突触间隙清晰可见，突触前后膜间吻合良好，突触后膜可见均匀增厚，突触曲面弧度规整，突触小泡丰富，线粒体结构完整；模型组突触间隙消失，突触前后膜界限模糊，弧度不规则，突触小泡较少，线粒体嵴肿胀甚至消失；药物组突触结构疾病正常，突触间隙清晰可见，突触后膜均匀增厚，突触小泡较多，线粒体结构完整、丰富。见图2。

图1 各组大鼠海马区MAP-2、SYP、PSD-95的表达（400×）Fig.1 Expression of MAP-2,SYP,PSD-95 in hippocampus among different groups(400×)

表4 各组大鼠海马突触相关蛋白表达比较（±s）Tab.4 Comparison of expression of synaptic associated proteins among different group(±s)

表4 各组大鼠海马突触相关蛋白表达比较（±s）Tab.4 Comparison of expression of synaptic associated proteins among different group(±s)

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与假手术组比较，##P＜0.01。Note:Compared with model group,*P＜0.05,**P＜0.01;compared with sham-operated group,##P＜0.01.

3 讨论

VD是最常见的认知功能障碍病因之一，属中医“文痴”“呆病”“善忘”“郁证”等范畴。《医方集解》言：“人之精与志，皆藏于肾。肾精不足则志气衰，不能上通于心，故迷惑善忘也。”[8]因此肾虚，肾中精气不足可影响到心神而导致痴呆。此外，《灵枢·平人绝谷》言“血脉和利，精神乃居”，进一步指出血脉通畅是精神、情智、认知正常的必要条件。因此，治疗VD多以补肾填精、健脾益气、疏通经络等方药配伍而获良效。

图2 各组大鼠海马CA1区突触结构透射电镜图像Fig.2 The synaptic images of three groups observed with TEM

MDP组方中以山药为君，重在补肾益气；以熟地黄、何首乌、全当归为臣，加强补肾填精、活血通络、滋阴养血的功效，补而不滞；另以杜仲、川芎为佐，进一步加强补肾通络功效，再佐以西党参、茯苓、白术益气健脾，意为补后天之本以促先天之本功能健旺；以白芍、枸杞、菖蒲、远志、五味子为使调肝宁神，同时秉承肝肾同源、精血互化理论，从而达到滋阴润燥、调摄精神之功效。诸药合用，使肾气健旺、脑络通顺、五脏得调，自当五神各安其位、五体灵活、五官灵敏而反应如常。

大鼠和人类一样，具有完整的Willis环，因此本研究采用2-VO法建立大鼠VD模型。双侧颈总动脉阻断后可导致大鼠海马慢性供血不足。海马CA1区神经元对缺血、缺氧损害极其敏感[7]，颈总动脉阻断导致的缺血缺氧性病变势必导致神经元凋亡及突触的变性和丢失，使突触数量下降，可塑性降低，突触相关蛋白表达发生改变，并进一步影响突触的结构与功能。研究表明，突触相关蛋白可调控突触的生长、发育、成熟，并与突触可塑性密切相关，当其表达发生改变后可使个体产生神经精神症状，出现焦虑、感觉与认知功能受损、交流缺陷以及社会活动缺陷等[9]，因此突触相关蛋白的表达是突触数量及功能状态的标志，能够从微观层面反映突触的病理生理变化。

本研究发现，MDP能明显改善VD大鼠的学习记忆能力。免疫组化检测则进一步证实MDP能明显促进突触相关蛋白SYP、MAP-2、PSD-95的表达，药物组明显高于模型组及假手术组。SYP是一种突触前囊泡特定蛋白，由313个氨基酸组成，分子量38kDa，对突触形成和突触功能的维持意义重大，是突触重建的重要标志。SYP可作为突触结构的标记物，在神经外科手术中常用来标记突触终末，避免神经损伤[10]。MAP-2主要表达在神经元胞体、树突、树突棘和突触后致密区，作为神经元树突生长的标志蛋白，与突触可塑性与树突棘的形态与功能密切相关，在神经元突起形成和突触可塑性调节中发挥重要的作用[11]，与癫痫等疾病密切相关。PSD-95是一种由724个氨基酸构成的突触后蛋白，与突触的可塑性、学习记忆等相关，其变异可导致个体智能障碍。PSD-95参与了树突棘的生长、发育、分支及成熟，在突触信号修饰方面也发挥作用[12]。神经元PSD-95的表达增多和突触兴奋性增强相关[13]，而AD及轻度认知障碍（minimal cognitive impairment，MCI）患者的神经元PSD-95表达则明显下降。

本研究中药物组MAP-2表达增高说明MDP可促进树突形成，从而促进新突触形成，改善突触可塑性，增强大鼠的学习和记忆能力；另一方面，药物组大鼠SYP与PSD-95也明显升高，说明MDP能够保存现有突触，并促进了突触重建与再生，从而保护了缺血缺氧损伤的神经组织。PSD-95与MAP-2表达增加，也提示神经元树突的生成和树突棘的增多和成熟，为突触重建创造了条件。电镜观察也证实MDP治疗后大鼠突触结构正常，尺寸增大，突触囊泡丰富，这些为神经信息的高效传递和处理创造了物质条件。模型组突触间隙消失，突触前后膜界限不清，正常曲面消失，突触囊泡减少或消失，线粒体嵴肿胀及破坏。相应的SYP、MAP-2、PSD-95表达均显著低于假手术组及药物组，表明突触破坏、萎缩乃至消失，与其学习记忆能力降低不无关联。

综上所述，MDP通过补肾填精、益气通络，使肾气健旺、脑络通顺、五脏得调，从而改善VD患者的认知功能。动物实验证实该方能促进突触再生，增强突触相关蛋白SYP、PSD-95、MAP-2的表达，保证了突触正常的生理结构和功能，为高效有序地处理神经信息提供了物质基础。本研究结果为MDP在临床上的推广应用提供了进一步的实验依据。

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