电喷雾离子迁移谱快速检测次乌头碱的研究

孔景临 刘卫卫 秦墨林 李宝强 丁俊杰 陈创 李海洋

1.防化研究院，北京 102205；2.中国科学院大连化学物理研究所，辽宁大连 116023

离子迁移谱（Ion Mobility Spectrometry，IMS）技术是20世纪中期发展起来的一种微量化学分析技术，其分析原理是依据电场中离子因质量、形状、带电荷情况的不同导致漂移时间的差异实现离子分离和测定。该技术与质谱有相似之处，但不需要真空系统，也被称为常压质谱。与质谱相比，IMS易于实现、设备简单、造价低廉，适合现场快速检测，已成为美军、北约部队的点源检测装备以及欧美国家反恐应急准备的首选器材[1-2]。但外军现有离子迁移谱检测装备主要采用63Ni，244Am等放射性电离源或是以电弧放电方式，使气体样品离子化，这类电离源不能用于非挥发性化合物以及生物样品的分析，检测范围受限，并且因存在放射源，使用及报废存在隐患。20世纪90年代，电喷雾电离（Electrospray Ionization，ESI）被用于溶液中蛋白质研究，液体样品也可以通过ESI引入漂移管，通过离子迁移谱的方式进行分析[3-5]。目前，电喷雾离子迁移谱（Electrospray Ionization-Ion Mobility Spectrometry，ESIIMS）已经与质谱技术联用（ESI-IMS-MS）发展成为蛋白质组学研究中的先进手段，在多肽和蛋白质结构研究方面发挥着重要作用[6-7]。

ESI-IMS大大拓宽了传统IMS技术检测对象范围，为非挥发性、液体以及生物样品的现场快速检测提供了新途径，而这类样品的现场快速检测需求量很大，特别是在天然产物化学、制药、食品和药品安全监管、司法物证鉴定等领域。现有的高效液相色谱法（HPLC）、液质联用（LC-MS）等均需使用大型实验室设备，不仅运转成本高，也无法用于现场快速检测。2012年美国Excellism公司推出可车载ESI-IMS仪，但价格不菲[8]。本项目组在前期研究中自行搭建了电喷雾离子迁移谱仪，较为系统地研究了影响离子迁移谱谱图质量的主要实验参数，包括尾吹气流速、电喷雾溶液组成、电喷雾溶液流速等，建立了基本的实验方法[9]。并在前期研究的基础上，利用自制平台，开展了对非挥发性样品的检测研究。我们以乌头类中药中常见的剧毒成分次乌头碱（Hypaconitine）作为检测对象，验证了自制平台的效果。这类药材常有因不当治疗、误食、蓄意投毒等导致的中毒的案例报道。研究发现，离子门脉冲宽度对检测灵敏度的影响较大，通过参数优化，自制平台对次乌头碱的检测灵敏度可达800ng/mL。从进样到检测次乌头碱的信号在1min之内即可完成，效率明显高于HPLC。

纸喷雾（Paperspray）作为一种敞开式常压电离方式因其具有免除样品前处理、可直接分析等优点成为当前快速检测的研究热点[10-11]。本实验还着眼于现场使用的方便性，将纸喷雾这种敞开式常压电离方式与漂移管结合起来，形成纸喷雾离子迁移谱（paper spray ionization-ion mobility spectrometer，PSI-IMS）平台，用纸喷雾替代喷雾针也实现了对次乌头碱的快速检测。

1 实验部分

1.1 实验装置、条件和试剂

1.1.1 实验装置及条件 实验室搭建的ESI-IMS装置如图1所示，主要包括电喷雾电离源区、去溶剂化腔体、Bradbury-Neilsen离子门（BNG）、离子迁移区以及法拉第盘检测器，去溶剂化腔体的内径为14 mm，离子迁移区的内径为25 mm。ESI离子源的喷雾针为液相色谱进样针（AGE，W-107，100 μL），电喷雾时高压直接施加进样针上，喷雾针的针尖和对电极之间保持轴向距离10 mm，迁移区长度为88 mm。纸喷雾离子迁移谱实验装置与之类似，如图2所示，实验中将滤纸剪成三角形，用通电的镊子夹持，滤纸尖端对准去溶剂化区（图3）即可实现喷雾针功能。

图1 ESI-IMS实验平台实物图

图2 PSI-IMS实验平台实物图

图3 PSI电离装置局部放大图

1.1.2 试剂 次乌头碱购自百灵威（纯度³98%），甲醇、甲酸（Fluka试剂），准确称量次乌头碱，用甲醇溶解配成一定浓度的溶液，采用逐级稀释的方法配制各种浓度的稀溶液。

1.2 实验方法

实验参数设置为：离子迁移管内气压为环境气压，离子迁移管使用Bradbury-Nielsen型离子门，离子门脉冲宽度可调，离子门关门电压控制为150 V。迁移管工作温度为室温25℃，漂气为空气，流速可调，迁移区电场强度为368.75 V/cm，电喷雾电压3000 V。离子迁移谱图的扫描时间为40 ms，平均次数为16次，单次检测时间小于1 s。以正离子模式检测次乌头碱。以喷雾针与纸喷雾检测次乌头碱的差别主要在于上样方式的不同，前者使用步进电机以2 ml/min的流速推出待测液，而纸喷雾检测时将样品直接滴加在滤纸上。

2 实验结果

2.1 喷雾针方式检测次乌头碱的实验结果

2.1.1 参数优化 本实验使用的样品为次乌头碱（hypaconitine，CAS号6900-87-4），其结构式如图4所示，分子式C33H45NO10，分子量615.71，白色柱状结晶。对小鼠的急性毒性LD50（经口）为5.8 mg/kg，毒性分级为剧毒。考虑到次乌头碱分子结构中的氨基易于质子化，因此采用正离子模式进行离子迁移谱实验。着眼于现场使用的需要，以空气为漂气。图5为室温条件下，检测1.1 mg/mL次乌头碱所获得的信号谱图。实验发现，当离子门脉冲宽度小于200 μs时，基本上观察不到次乌头碱信号峰；当增加离子门的脉冲宽度到200 μs 才能观察到微弱的次乌头碱信号峰（对应图5中谱线1）；进一步增加离子门脉冲宽度到300 μs时，可以观察到明显的次乌头碱信号峰（对应图5中谱线2）。分析这一现象，可以判断谱峰信号强弱与Bradbury-Neilsen离子门（BNG）本身的清空效应有关。次乌头碱分子量较大，约化迁移率较小，通过BNG的时间较长，需要较长的离子门开门脉冲才能够通过BNG。这一结果指导了实验参数的设定。另外，改变电喷液的pH值，添加甲酸，使其浓度达到0.1%，使用该弱酸性电喷液并不能提高次乌头碱的检测灵敏度。这是因为正离子模式下，喷雾针尖端处发生氧化反应[11]，电喷液中的甲醇被氧化脱氢，氢则与次乌头碱氨基氮的孤对电子结合使次乌头碱质子化，体系中甲醇占绝大部分，这为阳离子的形成提供了足够的质子来源，因此，加入甲酸起不到明显作用。

图4 次乌头碱的分子结构

图5 不同离子门脉冲宽度下次乌头碱的离子迁移谱图

2.1.2 次乌头碱的离子迁移谱图分析 图6是在优化的实验条件下测定的不同浓度次乌头碱溶液的离子迁移谱图。其中谱线1是不含次乌头碱的空白对照，为甲醇溶剂谱线。依次往上的谱线2、3、4、5、6分别是800ng/mL，4mg/mL，8mg/mL，40mg/mL，80mg/mL的次乌头碱溶液的离子迁移谱图。由图可见20.8ms处有一明显信号，在正离子检测模式下，该谱峰对应的是质子化的次乌头碱。由约化迁移率的公式[2]，计算次乌头碱的约化迁移率。式中L为迁移区长度（cm）、td为离子漂移时间（s）、P，T分别为实验条件下的压力（mmHg）及温度（K），

将平台及实验中的参数及漂移时间代入后，算出次乌头碱的约化迁移率为1.23 cm2V-1s-1。

图6 不同浓度次乌头碱在ESI-IMS中的响应谱图

对比图6中一系列谱线，可以看到次乌头碱离子峰的信号强度与溶液浓度存在正相关。在此基础上对平台的检测次乌头碱的灵敏度和动态响应范围进行了分析。图7为次乌头碱离子峰面积随浓度变化的动态响应曲线。由图7可见溶液浓度与信号强度呈现指数变化趋势，在次乌头碱溶液浓度较高时，响应信号逐渐趋于平台状，这可能与一定脉冲间隔内，进入离子门内离子数目达到饱和有关。图8是该平台对次乌头碱检测限的实验结果，其中谱线1为空白对照，谱线2为浓度为800ng/mL的次乌头碱溶液的检测信号。其离子峰的信号强度和基线噪声达到S/N=3的水平，该浓度可以定义为平台对次乌头碱的实际检出限（LOD）。由此可以计算出用此自制平台，对次乌头碱的检测灵敏度为 1.3´10-6mol/L。

图7 次乌头碱在ESI-IMS中的动态响应曲线

图8 次乌头碱在ESI-IMS中的检测灵敏度

2.2 纸喷雾检测次乌头碱的实验结果

滤纸剪成近似的等腰三角形，尖角约30°，先将溶剂滴在滤纸上，在三角形的滤纸的底边施加高电压，在电场驱动下，溶剂向滤纸的尖端迁移并在尖端放电，形成喷雾流，检测到图9所示的溶剂背景信号。再将100 mg/mL的次乌头碱溶液滴在纸片上，谱图上如图10所示。图中除出现溶剂峰簇外，在漂移时间为21.2 ms处出现次乌头碱的信号峰，这与喷雾针电离方式检测的次乌头碱的漂移时间基本一致。纸喷雾电离的原理与喷雾针离子化相同，实际上喷雾针的变形，但纸喷雾电离不需要其他气体协助去溶剂化，还具有喷雾针所不具备的分离优点。

图9 纸喷雾离子迁移谱检测的溶剂背景信号

图10 次乌头碱经纸喷雾电离后的离子迁移谱

3 讨论

离子化源作为离子迁移谱仪器的一个重要组成部分，起着将待测样品离子化的作用，其性能在一定程度上决定了IMS可以检测化合物的范围、灵敏度以及线性范围等指标。在IMS仪器中，特别是商品化的IMS仪器中，使用最广泛的离子化源为放射性电离源。这种离子化源检测的样品主要是气体或者具有挥发性的样品，对于半挥发性和难挥发的样品则需要特殊的热解析进样器来辅助进样，限制了IMS在热不稳定性样品和生物样品分析中的应用。ESI用作离子迁移谱的电离源，可以将液体样品中的分析物或固体样品溶解后直接转化为气相离子，大大拓宽IMS的检测范围。与HPLC等实验室仪器相比，ESI-IMS不仅造价低廉，还具有不需要使用各类色谱纯溶剂，不需要耗材，经济性好、保障要求低等优点。此外，ESI-IMS易于小型化，在环境污染物、保健品药品违法添加、爆炸物以及生物样品的现场分析中展现了良好的前景。

本实验目的在于研发现场快速检测毒害物质的电喷雾离子迁移谱国产设备，为现场执法、应急响应和应急救援提供手段。本实验在自制平台的基础上，以次乌头碱为检测对象，优化实验参数，实现了对其较高灵敏度和快速检测。而传统的离子迁移谱仪是无法对次乌头碱这类非挥发性、分子量较大的生物碱类化合物进行的检测的。本实验使用纸喷雾电离替代喷雾针，也实现了对次乌头碱的检测。在现场使用条件下，纸喷雾比喷雾针更为方便，并且前者还具有喷雾针不具备的分离功能。纸喷雾电离局限性包括背景复杂的生物样品会影响定量分析、纤维素的自由羟基会影响极性化合物的洗脱等。下一步工作将在此平台基础上，优化纸喷雾的实验条件，提高纸喷雾的检测灵敏度，建立电喷雾离子迁移谱针对生物碱、多肽等不同类型毒害物质的检测方法，开发非挥发性、高分子量有毒化合物的离子迁移谱数据库，为这一自制平台发展成实用设备提供软件支持。

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