Atg3和Beclin1表达在乳腺癌新辅助化疗疗效预测中的价值

刘永波 陈奕至 郭怡辉 吕淑贞 穆颖 李艳萍

1.首都医科大学附属北京世纪坛医院乳腺外科，北京 100038；2.首都医科大学附属北京世纪坛医院病理科，北京 100038

新辅助化疗可使80%以上的乳腺癌患者原发肿瘤缩小、淋巴结转移数减少，从而降低肿瘤分期、为根治性手术创造条件，但也有20%的患者无法自新辅助化疗获益[1]。因此，早期预测患者新辅助化疗疗效，对于及时开展外科治疗、避免贻误手术时机有着重要意义，也是控制病情进展、改善患者预后质量的关键之一，但当前临床尚缺乏预测乳腺癌患者新辅助化疗疗效的客观指标[2]。近年来，有学者观察到自噬相关基因Atg3、Beclin1对肝癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤预后的影响，且已有研究印证了上述基因在乳腺癌发生发展中发挥的重要作用[3-4]。以此为基础，拟观察Atg3、Beclin1预测乳腺癌新辅助化疗疗效的价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象

自我院2014年5月至2017年3月经病理组织学检查明确Ⅲ期乳腺癌诊断[5]的女性患者中选取145例，患者均符合新辅助化疗适应证且病灶具有可测量性，排除已发生远处转移者、入组前有抗肿瘤治疗史者、合并其他恶性肿瘤者以及合并心、肝、肾等脏器严重功能不全者。患者年龄33～74岁，平均（56.17±11.89）岁，发病位置：左侧76例，右侧69例；病理类型：浸润性导管癌131例，浸润性小叶癌6例，腺鳞癌3例，炎性乳腺癌3例，粘液癌2例。此次研究已征得我院医学伦理委员会批准，患者均知情同意并签署书面协议。

1.2 治疗方案

患者均接受ET新辅助化疗方案治疗[6]：多西他赛（赛诺菲制药有限公司，国药准字J20140039，规格0.5 mL:20 mg）75 mg/m2静脉滴注（持续3 h），d1；表柔比星（辉瑞制药有限公司，国药准字H20000496，规格10 mg）90 mg/m2静脉滴注，d2。3周为1周期，患者新辅助化疗均持续4周期，4周期后参照实体瘤疗效反应评价新标准（RECIST v1.1）评价其临床疗效[7]：完全缓解（CR）：所有目标病灶消失，任何病理性淋巴结的短轴值均＜10 mm；部分缓解（PR）：以临界半径的总和为参照，所有目标半径的总和减小≥30%；疾病进展（PD）：以目标病灶半径最小值为参照，所有目标病灶半径的综合增加≥20%且半径总和增加≥5 mm，或出现新的病灶；疾病稳定（SD）：介于PR、PD之间。以CR＋PR为有效，SD＋PD为无效。

1.3 分析方法

于患者新辅助化疗前取其粗针穿刺活检病灶标本，使用实时荧光定量PCR法检测Atg3、Beclin1 mRNA表达情况，使用免疫组化法检测Atg3、Beclin1染色情况，检测方法参照相关文献[7]，结果判定标准[8-9]：实时荧光定量PCR法：以2-△△Ct法计算相对表达比例；免疫组化法：根据5个400×随机视野内Atg3、Beclin1染色强度及阳性细胞比例判定结果，染色强度不着色、淡黄色、棕黄色、黄褐色分别计0分、1分、2分、3分，阳性细胞（胞质黄色-棕褐色颗粒）＜5、5%～＜25%、25%～＜50%、50%～＜75%、≥75%分别计0分、1分、2分、3分、4分。染色强度积分及阳性细胞积分乘积为总分，总分0分、1～4分、5～8分、9～12分分别为阴性（-）、弱阳性（+）、中阳性（++）、强阳性（+++），-为不表达，+为低表达，++、+++为高表达。根据化疗4周期后疗效，将患者分别纳入有效组、无效组，使用SPSS 19.0软件分析，采用χ2检验或t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。比较两组患者Atg3、Beclin1表达情况，总结Atg3、Beclin1对乳腺癌新辅助化疗疗效的预测价值。

2 结果

145例患者均完成4周期新辅助化疗，化疗结束后，CR 37例，PR 55例，SD 41例，PD 12例，总有效率为63.45%（92/145）。

新辅助化疗有效组Atg3、Beclin1基因mRNA相对表达比例均高于无效组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 有效组与无效组患者Atg3、Beclin1基因mRNA相对表达比例比较（%，x±s）

新辅助化疗有效组癌细胞内Atg3、Beclin1免疫组化染色高表达率分别为88.04%、82.61%，均高于无效组的7.55%、3.77%，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 有效组与无效组患者免疫组化染色结果比较（n/%）

3 讨论

新辅助化疗目的是对有局部治疗机会的患者行前期化疗，从而为后期手术治疗或局部放射治疗创造条件[10]。本研究145例乳腺癌患者均接受ET方案新辅助化疗，其临床总有效率为63.45%，说明多数乳腺癌患者可自新辅助化疗中获益。对新辅助化疗药物不敏感与患者基因表达差异有关，而自噬相关基因被认为可对新辅助化疗疗效造成明显影响[11]。自噬相关基因主要主导细胞自噬现象，细胞自噬是真核生物为维持细胞内环境稳态而循环利用细胞内分子、蛋白的重要生理过程，大量研究显示，在肿瘤发生早期，自噬可通过肿瘤细胞内因增殖作用，产生大量细胞器、蛋白，从而维持细胞正常生长与基因的稳定性，并抑制肿瘤生长；而肿瘤细胞自身自噬作用可用于维持自身稳态，并通过靶向自噬过程对抗化疗药物的毒性作用[12-13]。

Atg3位于人3号染色体上，在调控自噬体形成的过程中发挥着重要作用。一方面，Atg3可通过编码蛋白作用，作为E2酶参与自噬催化过程，参与自噬体形成；另一方面，Atg3可维持线粒体稳态，确保细胞整体稳定性[14]。作为新辅助化疗方案中的重要组成部分，多西他赛可抑制微管蛋白功能，干扰Atg3引导的上皮间质转化，发挥抗肿瘤效果[15]。在本次研究中，有效组患者化疗前病灶组织Atg3 mRNA高表达，说明该组患者可能对化疗药物更为敏感，因此，可以认为，新辅助化疗能够通过靶向调控Atg3表达，下调肿瘤细胞自噬活性，显现治疗效果。

Beclin1是酵母自噬基因Atg6/Vps30同源基因BECN1的标记蛋白，主要参与自噬体产生与成熟过程，也是近年来新发现的重要自噬相关蛋白之一[16]。作为自噬过程启动的关键蛋白，Beclin1可与Ⅲ型PI3K形成复合体，调节Atg蛋白在自噬前体结构中的定位，从而促进自噬体的形成[17]。同时，基础研究显示，自噬活化可促使乳腺癌细胞阿霉素耐药产生，而表柔比星类化疗药物可阻止mRNA形成过程并抑制拓扑异构酶Ⅱ，从而拮抗Beclin1介导的细胞恶性行为，增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性[18]。因此，高水平Beclin1表达者往往对化疗更为敏感。

因此，可以认为，Atg3和Beclin1表达能够用于乳腺癌新辅助化疗疗效预测，化疗前病灶组织较高的Atg3和Beclin1表达量往往意味着更为理想的治疗效果，而Atg3和Beclin1低表达或不表达可能是导致患者化疗敏感性不佳的主要原因。此次研究的局限性在于未对患者治疗后病灶组织Atg3、Beclin1表达进行再次检测，在今后的研究中，补充这一环节有助于进一步了解ET方案对自噬相关基因表达的影响，以为乳腺癌靶向治疗药物的选择与探索提供新的思路。

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