延边地区圈养黑熊细小病毒感染的血清流行病学调查

袁昕慧 金海峰 袁慧艳 鞠 铭 王 妍

(延边大学农学院动物医学系，延吉，133000)

犬细小病毒病是由犬细小病毒(Canine parvovirus，CPV)引起的多发于幼犬的高致死性传染病，主要表现为出血性肠炎和心肌炎［1］。1982年，梁士哲等［2］首次报道了类似CPV所致的犬出血性肠炎，随后此病在我国大范围内蔓延开来，并已分离到多株病毒株。该病多呈地方性流行，虽无明显的季节性，但以冬春季多发［3］。最初认为 CPV主要感染犬科动物，但由于CPV变异速度快，最早的CPV－2在出现后短短几年时间发生抗原漂移，在抗原性、宿主范围和血凝性方面均发生了变化。在对多种野生动物猫泛白细胞减少症(FPV)基因型调查中，已证实它的变异型CPV－2a/2b在自然条件下也能感染猫科(Felidae)、鼬科(Mustelidae)等多种肉食兽，其危害不容忽视［4－6］。本试验为了解 CPV在黑熊中的流行情况，从延吉熊场临床采集数份疑似 CPV感染血清样品，用ELISA法对其进行鉴定，旨在为延边地区黑熊养殖业中细小病毒的流行情况进行初步分析，并有助于及时诊断和做好防治措施。

1 材料与方法

1.1 材料

血液采于延吉某两个熊场，犬细小病毒抗体ELISA检测试剂盒购自上海润裕试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 样品与处理

无菌采集血液，加入适量肝素，制成抗凝血。3000转离心30 min后取上清。

1.2.2 犬细小病毒抗体检测方法

经离心处理过的样品上清使用犬细小病毒抗体ELISA试剂盒根据使用说明书进行具体操作。

①从室温平衡20 min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃;

②设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50 μL;

③待测样本孔先加待测样本10 μL，再加样本稀释液 40 μL;

④随后标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗原100 μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60 min;

⑤弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1 min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次(也可用洗板机洗板);

⑥每孔加入底物A、B各50 μL，37℃避光孵育15 min;

⑦每孔加入终止液50 μL，15 min内，在450 nm波长处测定各孔的OD值。

1.2.3 ELISA阴、阳性判定标准

临界值计算:临界值=阴性对照孔值+0.15。阳性判断:样品OD值＞临界值，样品为阳性。阴性判断:样品OD值＜临界值，样品为阴性。

2 结果与分析

本试验ELISA法检测49份黑熊血液样品，检测结果显示:共检出阳性样品27份(表1)熊的CPV抗体阳性率为55.1%，表明CPV在东北黑熊中较为流行。

3 讨论

犬细小病毒病是犬的一种重要传染病，其流行使养犬业损失巨大，同时也对野生动物活动构成严重威胁。迄今为止，CPV只有一个抗原型，即CPV-2，但不同毒株间抗原性有所差异，而且已出现了多个亚型，即CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c(a)和 CPV2c(b)。CPV-2型出现后很快世界广泛传播，连续传播几年后，已经发生抗原漂移，在抗原性、宿主范围和血凝性上都发生了变化［7］。最初的主要感染犬科动物变得也能感染猫、幼熊、貂(Martes spp．)等动物。由于ELISA法在检测CPV抗体方面具有特异性高，成本低廉，操纵简单等优点，本试验主要利用双抗原夹心ELISA法来检测CPV在黑熊中的流行情况，49份黑熊血液样品中有27份呈阳性，阳性率为55.1%。本项研究为以后熊的细小病毒感染的预防与控制提供了重要的参考。

表1 ELISA法检测黑熊血清样品结果Tab.1 Results of black bear serum sample by Elisa

［1］ 王居平，吴玄光，向瑞平，等．犬细小病毒病的诊断技术［J］．中国预防兽医学报，2004，26(4):316－320．

［2］ 梁士哲，魏喜仁，范文光，等．狗传染性肠炎的研究1、腹泻狗粪便中检出的细小病毒样颗粒［J］．上海畜牧兽医通讯，1982，2(4):172－175．

［3］ 孔繁德，陆承平．犬细小病毒病原特性的研究概况 ［J］．中国兽医科技，1995，25(1):18－19．

［4］ Parrish C R，Aquadro C F，Strassheim M L，et al．Rapid antigenic－type replacement and DNA sequence evolution of canine parvovirus［J］．Journal of Virology，1991，65(12):6544 －6552．

［5］ Parrish C R，O'Connell P H，Evermann J F，et al．Natural variation of canine parvovirus［J］．Science，1985，230(4729):1046 －1048．

［6］ Truyen U，Agbandje M，Parrish C R．Characterization of the feline host range and a specific epitope of feline panleukopenia virus［J］．Virology，1994，200(2):494－503．

［7］ 李河林，焦铁军，刘淑红，等．犬细小病毒病研究进展［J］．动物医学进展，2008，29(5):73－77．