低氧环境对高原鼠兔骨骼肌HIF-1α和VEGF表达的影响

谢惠春 罗巧玉 陈 志 乔 枫

(青藏高原药用动植物资源青海省重点实验室，青海师范大学，西宁，810008)

在缺氧以及组织缺血的生理条件下，低氧诱导因子－1(Hypoxia-inducible factor，HIF-1)对机体恢复稳态有着重要的意义。HIF-1α在细胞代谢调控中倾向于调控糖酵解途径中相关酶的基因转录与表达，如乳酸脱氢酶，己糖激酶等［1－2］，而 HIF-2α却在细胞脂肪酸代谢途径中发挥重要的作用［3］，HIF-1α亚基的积累对保护组织对抗低氧的几个靶向基因起调控的作用［4］。同时，在氧气供应不足及血流供应不足的情况下，血管内皮生长因子(VEGF)被认为是一种由细胞产生的信号蛋白，在恢复组织供氧，以及改善血管功能和血管生成中起到重要的作用［5］。

高原鼠兔(Ochotona curzoniae)，一种生活在青藏高原高寒草甸海拔约3000 m的小型植食性哺乳动物。能够完全适应高寒缺氧的环境［6］。由于高原鼠兔具有低氧耐受性，使其成为一种用于研究急性或慢性缺氧下机体生理和生态适应性的独特模式动物［7－8］，同时被广泛地用于研究机体适应低氧环境潜在的细胞和分子机制［9］。

骨骼肌纤维按其代谢过程的不同可分为氧化型和糖酵解型，例如，氧化型肌纤维主要使用氧化磷酸化生成ATP［10］。另外，氧化型肌纤维中含有大量的肌红蛋白，作为氧结合蛋白可以存储氧气并加速其递送至肌肉细胞内的线粒体中。与此相反，糖酵解型肌纤维具有较低水平的肌红蛋白，其获得能量的主要方式依赖于糖酵解［11］。然而，低氧环境中，两种肌纤维中HIF-1α和VEGF的表达还鲜有研究。

因此，我们的研究内容是在低氧暴露下，比较高原鼠兔和SD大鼠(Rattus norregicus)2种肌纤维中HIF-1α和VEGF的表达量及其对低氧应激的响应机制。此外，我们在后肢肌肉中注射HIF-1α的抑制剂2－甲氧基雌二醇(2-MeOE2)，然后检测骨骼肌中VEGF的水平，从而确定骨骼肌中HIF-1α对VEGF的影响。我们假设高原鼠兔与SD大鼠在低氧暴露条件下骨骼肌中HIF-1α和VEGF的表达量减少。同时我们推测在骨骼肌中HIF-1α可以调节VEGF的表达量。

1 材料与方法

1.1 实验动物

2014年5月，在青海省海北自治州祁连县野牛沟乡达玉村(E99°16'，N38°42'，海拔 3960 m)捕获 51只健康成年雄性高原鼠兔(150～200 g)，带回西宁(海拔2300 m)置于动物饲养箱内，饲以矮生嵩草(Carex alatauensis)、高山嵩草(Carex parvula)、早熟禾(Poa spp．)、二裂委陵菜(Potentilla bifurca)等生境青草和胡萝卜(Daucus carota)，适应3周后用于实验，78只SD大鼠购于青海省地方病研究所。

1.2 仪器及试剂

Innovative Instruments氧传感器(美国)，70 cm×70 cm×50 cm通风舱体(自制)，BIO-RAD X-mark酶标仪(美国)，MB100-4P微孔板孵育器(美国)，2-甲氧基雌二醇(Selleck Chem．Co．)，HIF-1α ELISA 试剂盒(Abcam Co．)，VEGF ELISA 试剂盒(R＆D System)，2%BSA溶液(50 mmol/L碳酸盐缓冲液pH 9.5配制)。

1.3 实验方法

1.3.1 低氧模拟

由氧传感器控制，舱体通风通入21%(O2/N2%)作为海平面对照混合气体，10.8%(海拔5000 m)氧气通风作为低氧胁迫环境模拟［11］。对照组以锯末作笼垫，棉花作巢材，室温(21±1)℃，光周期14L∶10D条件下正常饲养，后肢肌肉腓肠肌注射2-MeOE2模拟低氧暴露。

1.3.2 骨骼肌中HIF-1α和VEGF表达水平的检测

实验动物高原鼠兔(n=45)、SD大鼠(n=60)10.8%氧气通风低氧胁迫6 h后断头处死，对照组高原鼠兔(n=6)、SD大鼠(n=6)室内通风饲养，同一时段断头处死，取后肢腓肠肌。需要注意的是，腓肠肌深红色部分为氧化型肌纤维，浅白色部分主要是由糖酵解肌纤维构成。双位点免疫酶测定法(ELISA)检测骨骼肌中HIF-1α和VEGF的表达水平。用亲和纯化的多克隆兔抗HIF-1α抗体/小鼠抗VEGF抗体微量滴定聚苯乙烯96孔板。平行孔用纯化的兔/小鼠IgG非特异性信号评估。室温下温浴过夜，50 mmol/L Tris－HCl清洗板体后，2%BSA(pH 9.5)溶液孵育2 h。彻底清洗后，将稀释的样品和HIF-1α/VEGF的标准溶液分布在各板孔，室温过夜。洗涤后每孔加入半乳糖苷酶用以抗HIF－1α和VEGF。底物溶液37℃孵育2 h后酶标仪测定读数。

1.4 数据分析处理

所有数据使用双向重复测量，方差分析，用SE表示。实验数据采用SPSS 17.0软件进行统计分析，P＜0.05被认为是有统计学意义。

2 结果

结果显示，高原鼠兔(n=6)与SD大鼠(n=6)氧化和糖酵解型肌纤维中HIF-1α和VEGF的基础表达水平无显著性差异。在SD大鼠的氧化和糖酵解型肌纤维中HIF-1α表达量分别为(1.76±0.20)ng/mL和(2.51±0.22)ng/mL，而在高原鼠兔的氧化和糖酵解型肌纤维中HIF-1α表达量分别为(1.68±0.16)ng/mL(P＞0.05)和(1.97±0.31)ng/mL(P＞0.05)。此外，SD大鼠在氧化和糖酵解型肌纤维中VEGF表达量分别为(25.65±2.33)pg/mL和(27.62±3.12)pg/mL，而高原鼠兔分别为(23.45±2.81)pg/mL(P＞0.05)和(24.89±3.20)pg/mL(P＞0.05)。

图1 高原鼠兔和SD大鼠不同条件下氧化和糖酵解型肌纤维中HIF-1α和VEGF表达Fig.1 The expreesion of HIF-1α and VEGF in oxidative and glycolytic muscles of SD rats and pikas in different conditions

如图1所示，低氧胁迫下，无论是高原鼠兔(n=15)还是SD大鼠(n=20)氧化和糖酵解型肌纤维中HIF-1α和VEGF表达水平都显著高于常氧对照组。与常氧组比较，高原鼠兔HIF-1α和 VEGF表达的增幅量要显著低于SD大鼠的增幅量(P＜0.05)。此外，在后肢腓肠肌注射HIF-1α抑制剂2-MeOE2后，低氧暴露条件下，SD大鼠和高原鼠兔骨骼肌中VEGF的表达量与不注射2-MeOE2组相比显著降低(P＜0.05)。需要注意的是，我们还测定了在注射2-MeOE2后HIF-1α的表达水平，以证实其在这个实验中的有效性。SD大鼠(n=12)氧化型肌纤维中HIF-1α的表达量在响应低氧条件下为(3.26±0.36)ng/mL(P＜0.05)，在糖酵解型肌纤维中为(4.52±0.56)ng/mL(P＜0.05)，而注射2-MeOE2后SD大鼠(n=12)氧化型肌纤维中HIF-1α的表达量为(1.85±0.22)ng/mL，在糖酵解型肌纤维中为(2.62±0.32)ng/ml。

在低氧胁迫条件下，SD大鼠(n=20)和高原鼠兔(n=15)骨骼肌氧化型肌纤维中HIF-1α和VEGF的增高(r=0.76，P＜0.01)和糖酵解型肌纤维中HIF-1α和VEGF的增高(r=0.72，P＜0.01)存在线性关系(图2)。

图2 低氧应激下高原鼠兔和SD大鼠氧化和糖酵解型肌纤维中HIF-1α和VEGF的线性关系Fig.2 The linear relationship between the levels of HIF-1α and VEGF in oxidative and glycolytic muscles of SD rats and pikas in response to hypoxic stress

3 讨论

HIF-1α被认为是细胞进行代谢途径中一个关键的氧传感器［1－2］。在这项研究中，我们检测了后肢腓肠肌氧化和糖酵解型肌纤维中HIF-1α蛋白表达。如以往报道［12］，尽管在常氧条件下，高原鼠兔和SD大鼠氧化和糖酵解型肌纤维中HIF-1α的表达组间没有显著性差异，但是我们发现HIF-1α在糖酵解型肌纤维中的表达要显著高于氧化型肌纤维。此外，在低氧暴露条件下，HIF-1α的应激反应也表现为糖酵解型肌纤维高于氧化型肌纤维。重要的是，我们的研究表明，无论是高原鼠兔还是SD大鼠，氧化型肌纤维和糖酵解型肌纤维在响应低氧应激时均表现出HIF-1α的蛋白表达水平的升高。

根据能量代谢的途径不同，可将骨骼肌纤维可分为氧化型和糖酵解型［10］。在常氧条件下，骨骼肌纤维的类型由肌红蛋白含量决定，同时与HIF-1α的表达量具有相关性。氧化型肌纤维中含有较多的肌红蛋白，但HIF-1α含量较低［13］。同样的，糖酵解肌纤维中肌红蛋白水平低，但却含有高的HIF-1α。以往研究表明［14］，一个给氧调节系统主要是以肌红蛋白为基础的氧化肌纤维和以HIF-1α复合体为基础的糖酵解肌纤维。然而，在我们的研究中发现，在高原鼠兔无论是在氧化型肌纤维还是在糖酵解型肌纤维中HIF-1α的表达量相比SD大鼠都表现出弱的反应性，这可能提示，在长期低氧胁迫环境下，肌红蛋白与HIF-1α之间存在的平衡关系可能被改变。

此外，我们的结果表明，在低氧胁迫条件下，高原鼠兔和SD大鼠氧化型和糖酵解型肌纤维中血管内皮生长因子VEGF的表达水平都有提升。HIF-1α反应和VEGF反应之间存在密切的相关性。低氧诱导产生的VEGF水平的升高，在当HIF-1α被抑制剂抑制以后，后肢肌肉中VEGF水平降低。这表明，在低氧胁迫条件下，HIF-1α对调节骨骼肌VEGF的表达有重要的意义，其中一个重要的调节作用就是调节血管功能和提高血流量。

应当注意的是，低氧胁迫下，我们运用线性分析后得出骨骼肌中HIF-1α和VEGF表达水平具有密切的相关性。后期研究将针对VEGF抑制剂对HIF-1α表达水平的影响，从而最终确定两者之间的联系。

总之，该研究结果表明，(1)在低氧胁迫条件下，对比SD大鼠，高原鼠兔骨骼肌中HIF-1α和VEGF的功能反应表现出不敏感型;(2)在低氧环境中，HIF-1α对骨骼肌中VEGF起调节作用。我们对高原鼠兔在低氧胁迫条件下的生理生态适应及其低氧适应机制进行研究，意在揭示人体低氧组织适应/预适应的实质及机体抗/耐缺氧的生物学策略，同时为高原医学提供基础理论数据。

［1］ Ceradini D J，Kulkarni A R，Callaghan M J，et al．Progenitor cell trafficking is regulated by hypoxic gradients through HIF-1 induction of SDF－1 ［J］．Nature Medicine，2004，10(8):858－864．

［2］ Manalo D J，Rowan A，Lavoie T，et al．Transcriptional regulation of vascular endothelial cell responses to hypoxia by HIF-1 ［J］．Blood，2005，105(2):659－669．

［3］ Ratcliffe P J．HIF-1 and HIF-2:working alone or together in hypoxia［J］．The Journal of Clinical Investigation，2007，117(4):862 －865．

［4］ Wubs M，Saito K，Kohler S，et al．Gauging a quantum heat bath with dissipative Landau-Zener transitions［J］．Physical Review Letters，2006，97(20):200404．

［5］ Kim Y W，Byzova T V．Oxidative stress in angiogenesis and vascular disease［J］．Blood，2014，123(5):625－631．

［6］ 杜继曾，李庆芬．模拟高原低氧对高原鼠兔和大鼠器官与血液若干指标的影响［J］．兽类学报，1982，2(1):35－42．

［7］ Grace C R，Perrin M H，DiGruccio M R，et al．NMR structure and peptide hormone binding site of the first extracellular domain of a type B1 G protein-coupled receptor［J］．Proceedings of the National A-cademy of Sciences of the United States of America，2004，101(35):12836－12841．

［8］ Zbytek B，Slominski A T．Corticotropin-releasing hormone induces keratinocyte differentiation in the adult human epidermis［J］．Journal of Cellular Physiology，2005，203(1):118－126．

［9］ 谢惠春，罗巧玉，陈志，等．高原鼠兔繁殖季节血液指标、血气及性激素变化［J］．野生动物学报，2017，38(2):205－214．

［10］ Lieber R L．Skeletal muscle structure，function，and plasticity［M］．Maryland，USA:Lippincott Williams ＆ Wilkins，2009:116－200．

［11］ Chen Xuequn，Wang Shijun，Du Jizeng，et al．Diversities in hepatic HIF-1，IGF-I/IGFBP-1，LDH/ICD，and their mRNA expressions induced by CoCl2in Qinghai-Tibetan plateau mammals and sea level mice［J］．American Journal of Physiology-Regulatory Integrative and Comparative Physiology，2007，292(1):R516 －R526．

［12］ Pisani D F，Dechesne C A．Skeletal muscle HIF-1alpha expression is dependent on muscle fiber type［J］．The Journal of General Physiology，2005，126(2):173－178．

［13］ Lin Jiandie，Wu Hai，Tarr P T，et al．Transcriptional co-activator PGC-1α drives the formation of slow-twitch muscle fibres［J］．Nature，2002，418(6899):797－801．

［14］ Grange R W，Meeson A，Chin E，et al．Functional and molecular adaptations in skeletal muscle of myoglobin-mutant mice［J］．A-merican Journal of Physiology-Cell Physiology，2001，281(5):C1487－C1494．