miR146a及miR155表达与益赛普治疗类风湿关节炎疗效及安全性的相关性研究*

佘若男，李 博，胡秋侠，吴系美，谭锦辉，胡建云，唐群芳，汪小平

（广东省深圳市龙华区人民医院风湿免疫科，广东 深圳 518109）

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种可致残的自身免疫性疾病，以累及关节的滑膜炎为病理特征，是临床常见的风湿病。由于病因及发病机制尚未完全阐明，其治疗尚缺乏特异性手段。重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白（rhTNFR：Fc）是治疗RA的强力武器，国内较早生产的rhTNFR：Fc的商品名为益赛普，经国家食品药品监督管理总局批准用于RA的治疗。越来越多的证据显示，益赛普联合甲氨蝶呤（MTX）治疗RA可使RA的多种临床表现和实验室病情活动指标迅速得到改善，且治疗安全性较高[1-3]。在使用益赛普联合MTX治疗RA的过程中存在一个重要问题，即约30%的RA患者使用了足够疗程的益赛普治疗后病情无明显改善。本研究中针对这部分患者，观察了益赛普治疗中国RA患者的疗效，并探讨其外周血单个核细胞（PBMC）中miR146a及miR155的表达与益赛普治疗RA的疗效相关性。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

纳入标准[4]：符合1987年美国风湿病学学会（ACR）修订的RA分类标准；病情处于活动期（关节肿胀数或压痛数不少于3个；符合以下条件中的任意2个，随访当天的晨僵持续时间不少于45 min，C反应蛋白（CRP）不低于正常上限的1.5倍，血沉不低于28 mm/1 h；无结核、肝炎、肿瘤、多发性硬化、充血性心力衰竭、中枢性神经脱髓鞘病变和淋巴瘤等疾病；如果同时口服糖皮质激素，其剂量（相当于口服泼尼松的剂量）必须稳定在不超过10 mg/d，且至少持续4周；如果正在同时服用非甾体类抗炎镇痛药，则要求其剂量已稳定至少达2周；RA的关节外表现是指关节炎以外的其他所有临床表现，包括眼部病变、肺部病变、皮肤病变、类风湿结节、血液系统病变等[5]；签署知情同意书。

排除标准[4]：孕妇或哺乳期；严重的心、肺、肾、肝等脏器疾病或合并有血液、内分泌等其他系统病变及病史；4周内曾接受过关节腔内注射皮质类固醇治疗；急性或慢性感染性疾病，包括活动性结核；合并有恶性肿瘤或有恶性肿瘤家族史。

病例选择：选择我院门诊或住院风湿免疫科2013年6月至2016年3月收治的RA患者117例。其中，男18例，女 99例；年龄 21～74岁，平均（45±17）岁。

1.2 方法

所有患者均接受益赛普（三生国健药业＜上海＞股份有限公司，国药准字S20050058，规格为每支12.5 mg）联合MTX治疗，连续治疗3个月。益赛普的给药方法为每周1次，每次50 mg，皮下注射。

1.3 观察指标与疗效判定标准

疗效及安全性评估：记录入选的RA患者在治疗前及之后每个月的临床及实验室检查指标。主要包括全血细胞计数、尿常规、肾功能、红细胞沉降率（ESR）、CRP、类风湿因子（RF）、抗环瓜氨酸肽抗体（抗CCP抗体）及抗核抗体（ANA）等。血清中RF的测定采用免疫比浊法，抗CCP抗体的测定采用酶联免疫吸附法，ANA的测定采用间接免疫荧光法。

RA疗效评估，采用欧洲抗风湿病联盟（EULAR）与美国风湿病学会（ACR）共同修订的临床缓解新标准[4]，全部满足以下条件即为达到RA临床缓解新的标准：疼痛关节数量不超过1个，肿胀关节数量不超过1个，患者整体评估得分不超过1，ESR低于15 mm/1 h（女）、20 mm/1 h（男）或 CRP 水平不超过 1 mg/dL[4]。收集并记录在治疗过程中发生的所有不良反应，并分析不良反应与益赛普的相关性，必要时采取相应措施。

miR146a及miR155的表达水平检测：治疗前，采集外周血液15 mL，枸橼酸钠抗凝后用淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离PBMC，用1倍体积的PBS洗涤2次后定容至1 mL，吹打混匀后用细胞计数板计数。将以上PBMC转移至1.5 mL无 RNA酶的EP管中，按Trizol法说明书提取总RNA，用核酸紫外分析仪检测RNA浓度，保证光密度（OD260/280）位于 1.8～2.0，将 RNA 冻存于-80℃冰箱中备用。采用TaqMan®microRNA逆转录试剂盒（ABI公司），反应体系为 15 μL，按说明说操作。反应参数设置为：16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃5 min，然后4℃延伸。选用RUN6为内参照。采用ABI公司的TaqMan®PCR试剂盒，反应体系为20 μL，按说明书操作。反应参数设置为：95℃ 10min，然后95℃ 15s，60℃ 60 s，进行40个循环。

1.4 统计学处理

采用SPSS 18.0统计软件包进行分析。计量资料用±s表示，组间比较采取独立 t检验；计数资料用率表示，采用 χ2检验。所有统计检验都进行双侧检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

治疗后，临床缓解91例，其余26例未达到临床缓解标准。结果见表1和表2。

表1 RA患者的一般情况比较

表2 miR146a和miR155在各组RA患者PBMC的表达水平（±s）

表2 miR146a和miR155在各组RA患者PBMC的表达水平（±s）

项目miR146a miR155 RA患者（n=117）1.37 ± 0.62 1.86 ± 0.44缓解组（n=91）1.30 ± 0.62 1.87 ± 0.46未缓解组（n=26）1.59 ± 0.56 1.83 ± 0.33 t值-2.114 0.499 P值0.037 0.619

3 讨论

microRNA通过与靶mRNA结合引起靶mRNA降解或翻译受抑制，在转录后对靶基因的表达进行调控。一系列的研究证实，microRNA与多种疾病的发生相关，如癌症、糖尿病、心脏病、感染及某些风湿病等，并有可能成为这些疾病的诊断、病情活动性及疗效判断的标志物，甚至成为潜在的治疗靶点。microRNA为全面了解生命科学现象开了一扇新窗口，为疾病发生的机制与设计新的治疗策略研究提供了新视角。microRNA的研究成为了分子医学及分子生物学研究的热点领域。研究发现，与健康人相比，RA患者体内miR146a的表达存在明显异常，且还与RA患者体内一些炎症相关细胞因子的产生及RA的病情活动性与关节破坏相关[6-16]。以上研究结果提示，miR146a有可能在RA的发病中起了非常重要的作用，可能有助于RA的诊断及病情活动性评估。

益赛普是目前国内应用较多的治疗中重度RA的生物制剂，但对部分患者疗效欠佳，且价格昂贵，远远超出多数RA患者的经济承受能力。因此，如能提前判断出可能对益赛普治疗预期反应不好的RA患者，不再使用益赛普对这些RA患者进行治疗，不但可减轻其经济负担，且有利于及时换用其他治疗药物，争取更好的疗效。

本研究结果显示，接受益赛普治疗的117例RA患者在治疗结束时，达到临床缓解新标准的RA患者只有91例，这91例RA患者PBMC中miR146a的表达水平显著低于未达到RA临床缓解新标准的患者，但miR155的表达水平无显著性差异。

目前，多数临床研究将RA的临床缓解定义为DAS28评分不超过2.6分。由于疾病活动性评分28（DAS28）评分系统中疼痛关节数量的权重系数相对过大，故对于肿胀关节数目多于疼痛关节数目的RA患者，就显得过于宽松。本研究中采用了EULAR与ACR共同制订的RA的临床缓解新标准，克服了DAS28的局限性，因此观察结果更客观且可靠[4]。

综上所述，本研究结果初步表明，RA患者PBMC中miR146a的表达水平与益赛普治疗RA的疗效可能相关，且对于PBMC中具有较高miR146a表达水平的RA患者的疗效更好。以后仍需更大的样本进行验证，以期通过先检测miR146a的表达水平来预测益赛普治疗RA的疗效。

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