靶向敲除猪ApoE基因的CRISPR/Cas9系统构建及基因组检测

雒志新，闫 强，代冬梅, 张智英，王 昕

(西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌 712100)

载脂蛋白是指血浆脂蛋白中的蛋白质部分，此类蛋白有识别受体、激活脂蛋白代谢酶等功能。载脂蛋白ApoE是一条单一的相对分子量为34 kD的多肽链糖蛋白，主要由肝脏合成和分泌，它在哺乳动物血液循环系统和中枢神经系统胆固醇和脂质的运输中承担着重要的作用[1-2]。人类的ApoE蛋白具有多态性，它有三种亚型：E2, E3和 E4。它们的区别在于ApoE肽链第112和158位的氨基酸的不同[3]，其遗传多样性与人类多种神经退行性疾病和神经症状有关[4-5]。

近年来，CRISPR/Cas9作为第三代基因编辑技术[6]，已经成功应用于各种模型动物的构建中[7-9]。典型的CRISPR/Cas9系统由有DNA切割活性的Cas9核酸酶和通过碱基互补配对引导Cas9定点切割的gRNA组成[10-11]。与前两代人工核酸酶ZFN和TALEN相比，CRISPR/Cas9具有高效、成本低廉及易于组装等优点。本实验室前期构建的RG和RPG报告载体[12-13]，可以通过单链退火(single strand annealing, SSA)修复核酸酶造成的DNA断裂，并由报告基因的表达来反映核酸酶的工作情况，结合流式细胞仪或药物筛选的方式可以富集到经过人工核酸酶基因编辑过阳性细胞[14], 其高效性已经被多次验证[13,15-16]。

由于猪与人类新陈代谢和疾病免疫方面的高度相似性，已经成为研究人类疾病的重要模型动物[17]。本试验旨在利用CRISPR/Cas9系统和相应的报告载体，实现对猪ApoE基因的定点敲除，为后期构建ApoE敲除猪的动物模型提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株和质粒 HEK293T细胞、PK15细胞、JM109感受态细胞和PX330质粒均为本实验室保存；RG (Red-GFP)和RPG (Red-PuroR-GFP) 报告载体为本实验室前期构建[12-13]。

1.1.2 材料和试剂 限制性内切酶、T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶均购自NEB公司，质粒小提试剂盒和胶回收试剂盒购自Sigma公司，Sofast转染试剂购自厦门太阳马生物工程有限公司。

1.1.3 引物合成和测序 利用在线软件(http://crispr.mit.edu)，输入猪ApoE基因序列，分别设计两个靶位点5'-GGAGGACGTGCGCAACCGCT-3'和5'-CTTGGTGCTCTACCGCAGCG-3'；用Primer6设计包含靶序列的引物，序列见表1。引物合成及测序由英潍捷基(上海)贸易有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 CRISPR/Cas9系统表达载体的构建 将引物Apoe1 sgRNA F/Apoe1 sgRNA R、Apoe2 sgRNA F/ Apoe2 sgRNA R (表1) 两对引物分别拟合后与经过BsaI酶切后的PX330载体连接，转化涂板后，挑取单克隆。提取的质粒酶切鉴定后，送阳性单克隆测序。将构建正确的质粒分别命名为sgRNA1、sgRNA2。

表1 用于质粒构建和测序的引物序列Table 1 Primers used for vector construction, detection and sequencing

1.2.2 CRISPR/Cas9系统报告载体的构建 以猪基因组为模板，利用引物BamHI.ApoE.F /NotI.ApoE.R (表1)对含有靶序列的目的片段进行PCR扩增。扩增片段用BamHI和NotI酶切后，插入到同样酶切后的RG和RPG报告载体。将酶切正确的克隆分别利用PEGFP-F：5'-CTGGTCGAGCTGGACGGCGACG-3'， pCAG-F：5'-GCAACGTGCTGGTTATTGTG-3'测序，将结果正确的质粒分别命名为RG-ApoE、RPG-ApoE。

1.2.3 细胞培养 HEK293T和PK15细胞均培养在含有10%血清的DMEM培养基，并放置于37 ℃、5%CO2恒温培养箱中。

1.2.4 CRISPR/Cas9表达载体活性验证 将适量HEK293T细胞接种到24孔板，待其生长融合度至50%～80%时，采用Sofast推荐体系，将CRISPR/Cas9表达载体和RG-ApoE报告载体共转染至HEK293T细胞。48 h后，通过倒置荧光显微镜观察发光结果，并利用流式细胞仪对RFP+和GFP+阳性细胞进行计数。RFP+细胞代表了被成功转染的细胞，RFP+GFP+细胞代表了被打靶阳性细胞。CRISPR/Cas9表达载体活性通过RFP+GFP+阳性细胞数与RFP+阳性细胞数的比率计算。

1.2.5 基因组检测 将CRISPR/Cas9表达载体和RPG-ApoE报告载体共转至PK15细胞。转染24 h后，加入嘌呤霉素(终浓度为3.0 μg/mL)对细胞进行筛选。筛选5 d后，停止加嘌呤霉素。2 d后，收集细胞，提取基因组。以基因组为模版，利用Seq ApoE F(5'-GGGTCAGTCTTGCCGTCCTT-3')和NotI.ApoE.R (表 1)进行PCR扩增。将目的片段回收后，与T载体连接。经过转化涂板，随机挑取15个单克隆测序。CRISPR/Cas9系统的打靶效率通过阳性克隆数与挑选的总克隆数的比率计算。

2 结果与分析

2.1 CRISPR/Cas9系统表达载体和报告载体的构建

含有靶序列的PCR片段琼脂糖凝胶电泳检测结果见图1， PCR片段大约为139 bp。 进一步测序结果表明，靶向猪ApoE基因的两个表达载体sgRNA1、sgRNA2(图2)和相应的RG-ApoE，RPG-ApoE报告载体均成功构建(图3，图4)。

图1 猪ApoE基因PCR片段电泳检测M.Trans2K○R Plus DNA Marker (Transgen)；1.样品Fig.1 Electrophoresis detection of porcineApoE gene PCR fragmentsM.Trans2K○R Plus DNA Marker (Transgen)；1.DNA sample

图2 表达载体sgRNA1和sgRNA2测序结果Fig.2 Sanger sequencing results of expressing vector sgRNA1 and sgRNA2

图3 RG-ApoE报告载体测序结果方框中的序列为sgRNA的PAM序列。下同。Fig.3 Sequencing results of reporter vector RG-ApoESequences in boxes are PAM sequence of sgRNA.The same below.

图4 RPG-ApoE报告载体测序结果Fig.4 Sequencing results of reporter vector RPG-ApoE

2.2 CRISPR/Cas9表达载体活性验证

将CRISPR/Cas9表达载体和RG-ApoE报告载体共转染至HEK293T细胞48 h后，当CRISPR/Cas9表达载体工作时，RG-ApoE报告载体在靶序列处发生DNA双链断裂(Double Strand Break, DSB)，并通过单链退火拟合SSA的方式修复，原本在两端被靶序列间隔的标记基因GFP被修复而得以正常表达(图5)。倒置荧光显微镜观察结果显示，试验组(图6中b和c)sgRNA1、sgRNA2 均可观察到GFP和RFP的表达，而阴性对照组只观察到RFP(图6 NC)。荧光观察结果显示构建的靶向猪ApoE基因的CRISPR/Cas9在报告载体水平均表现出较高的活性。利用流式细胞仪对RFP和GFP阳性细胞进行计数，结果表明sgRNA1、sgRNA2的活性分别为6.50%和6.83%(图7)。

图5 RG报告载体的工作原理示意图当CRISPR/Cas9正常工作时，阳性细胞将既发红光又发绿光，否则只发红光。Fig.5 The schematic illustration of the RG surrogate reporter Both red and green fluorescence would be observed when CRISPR/Cas9 work as expected, otherwise only red fluorescence could be observed.

2.3 基因组检测

与RG-ApoE报告载体原理相同，当CRISPR/Cas9正常工作时，RPG-ApoE报告载体在靶序列附近会形成DSB，被其间隔的标记基因PuromysinR由于SSA修复而恢复抗性基因的功能(图8)，同时用倒置荧光显微镜观察到与PuromysinR融合的GFP基因也能够正常表达(图9)。将经过嘌呤霉素筛选后富集到的PK15细胞提取基因组后，用Seq ApoE F和NotI.ApoE.R (表1)进行PCR扩增。PCR片段及TA克隆测序结果显示，转染sgRNA1、sgRNA2的PK15细胞均在靶序列附近检测到突变(图10，图11)，且突变的概率分别为40%、53.3%。

图6转染HEK293T 48h后荧光观察结果
NC.阴性对照组；a.转染sgRNA1和RG报告载体；b.转染sgRNA2和RG报告载体；c.sgRNA1，sgRNA2和RG报告载体共转染组。
Fig.6 Representative visualization of fluorescence after transfection of HEK293T for 48 h
NC. negative control; a, transfected with sgRNA1 and the surrogate reporter (molar ratio 1:1); b. transfected with sgRNA2 and the surrogate reporter; c. transfected with sgRNA1, sgRNA2 and the RPG reporter (molar ratio 3:3:4)

图7 流式细胞仪对DsRed+和DsRed+eGFP+细胞计数结果Q1. DsRedC+ GFP-；Q2. DsRed+ GFP+；Q3. DsRed- GFP+；Q4. DsRed- GFP-。Fig.7 Flow cytometric quantification results of the DsRed+ and DsRed+GFP+ cells Q1. DsRed+ GFP-;Q2. DsRed+ GFP+;Q3. DsRed- GFP+;Q4. DsRed- GFP-.

3 讨 论

目前，基因编辑猪作为动物模型，已经广泛应用于人类疾病研究中[7,9,18]。ApoE基因序列和氨基酸序列与人类高度同源[19]。荧光原位杂交结果显示猪的ApoE基因位于第6号染色体q2.1，由四个外显子和三个内含子组成[19]。有研究显示ApoE蛋白主要在脑组织和肝脏中合成，是低密度脂蛋白受体和脂蛋白受体关联蛋白的配体，它会摄取低密度脂蛋白，参与血液循环系统中胆固醇和甘油三酯的代谢过程，对肝脏清除剩余脂蛋白起到重要的作用[4-5，20]。ApoE基因敲除兔与野生型兔相比，更容易出现高血脂和动脉硬化[8]。此外，ApoE还参与神经系统发育。大量研究表明ApoE蛋白的E4亚型会强烈地诱发阿尔兹海默症。ApoE基因敲除鼠除了表现出高血脂和动脉硬化，还出现记忆和行为的错乱[21]。总之，ApoE基因的异常与心脑血管疾病，如高血脂，糖尿病，动脉粥样硬化和阿尔兹海默症密切相关[22]。ApoE基因敲除动物模型的构建对研究心血管疾病分子机理和临床治疗有重要的意义。虽然ApoE基因敲除鼠和兔已经被报道[8]，但是由于猪与人类在免疫和新陈代谢方面的具有更高的相似性，因此构建ApoE基因敲除猪疾病模型，对于研究人类心血管疾病更具有临床意义。尽管李奎等利用CRISPR/Cas9成功生产出ApoE和LDLR双基因敲除的猪[23]，但是ApoE单基因敲除的猪动物模型还未见报道。

图8 RPG报告载体工作原理示意图当CRISPR/Cas9正常工作时，阳性细胞将既红光又发绿光，并且具有嘌呤霉素抗性。Fig.8 Schematic illustration of our RPG reporter Once the CRISPR/Cas9 worked as expected, the geneDs-red, PuromycinR and GFP genes would be expressed.

图9 转染PK15细胞4 d后荧光观察结果Fig. 9 Visualization of DsRed and GFP expression in PK15 cells after 4d of transfection

图11 PK15细胞转染sgRNA2后ApoE基因测序结果(嘌呤霉素筛选)Fig. 11 Sequencing results of ApoE gene after transfection of PK15 cells to sgRNA2(after puromycin screening)

CRISPR/Cas9作为相对成熟的基因编辑技术，由于其高效、成本低廉和易于组装等优点，已经被广泛应用于各种研究中[7-9,16]。本试验设计了靶向猪ApoE基因第三外显子的两个sgRNA。为了验证这两个sgRNA介导Cas9蛋白打靶的活性，同时还构建了含有靶序列的具有筛选富集阳性细胞功能的RG和RPG报告载体。RG报告载体虽然不能通过药物筛选富集阳性细胞，但是在HEK293T中通过观察阳性细胞GFP蛋白的表达，可以表明我们构建的CRISPR/Cas9系统能够在靶序列处造成DNA双链断裂，并触发报告载体进行SSA修复。经过流式细胞仪对GFP+和RFP+GFP+在HEK293T细胞的计数结果表明，sgRNA2活性略高于sgRNA1。此外，sgRNA1和sgRNA2共转染可以显著提高CRISPR/Cas9系统的打靶效率。此结果的原因可能为：①CRISPR/Cas9系统的活性极大地依赖于sgRNA的序列和结构，GC含量均匀的sgRNA活性高于GC含量较低或较高的sgRNA[24]；②对于sgRNA1/sgRNA2共转染组，只要其中的一对sgRNA工作，GFP基因就会表达。所以共转染组的活性大约是单个sgRNA组的两倍。此外，CRISPR/Cas9系统的工作效率还会受到细胞类型和转染效率的制约。我们利用构建的RPG报告载体，通过嘌呤霉素药物筛选成功富集到ApoE基因被CRISPR/Cas9编辑过的阳性PK15细胞。测序结果显示sgRNA1和sgRNA2在基因组敲除的效率分别为40%和53.3%。虽然在HEK293T细胞上表明sgRNA1和sgRNA2共转染可以显著提高CRISPR/Cas9系统的打靶效率，但是由于三质粒转染显著地降低了PK15细胞转染效率，未能在共转染组观察到GFP的表达，也没有通过药物筛选富集到足够多的阳性细胞。

ZFN系统和TALEN系统由锌指或转录激活类似物蛋白和FoKI核酸酶构成，这使得他们在构建时，需要对锌指或转录激活类似物蛋白进行改造，过程相对繁琐。而CRISPR/Cas9系统的构建只需要在已有的基础上对sgRNA中20nt的靶向序列进行替换即可。本研究结果表明，通过设计针对于猪ApoE基因的sgRNA构建的CRISPR/Cas9系统、结合具有富集阳性细胞作用的RPG报告载体，可以实现对猪ApoE基因的有效敲除。该结果为构建ApoE敲除猪动物模型提供了有力的技术支持。

参考文献：

[1] CHEN C H. Development of a melting curve-based allele-specific PCR of Apolipoprotein E (APOE)genotyping method for genomic DNA, guthrie blood spot, and whole blood[J]. PLoS ONE, 2016, 11(4): e0153593.

[2] ZHU X J, CHEN L H, LI J H. The Effects of aerobic exercise on plasma adiponectin level and adiponectin-related protein expression in myocardial tissue of ApoE(-/-)mice [J]. Journal of Sports Science & Medicine, 2015, 14(4): 877-882.

[3] PHILLIPS M C. Apolipoprotein E isoforms and lipoprotein metabolism [J]. IUBMB Life, 2014, 66(9): 616-623.

[4] VILLENEUVE S, BRISSON D, MARCHANT N L, et al. The potential applications of Apolipoprotein E in personalized medicine [J]. Frontiers in Aging Neuroscience, 2014, 6:154.

[5] LOPEZ M F, KRASTINS B, NING M. The role of apolipoprotein E in neurodegeneration and cardiovascular disease [J]. Expert Review of Proteomics, 2014, 11(3): 371-381.

[6] CONG L, RAN F A, COX D, et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems [J]. Science, 2013, 339(6121): 819-823.

[7] CHADWICK A C, MUSUNURU K. Genome editing for the study of cardiovascular diseases [J]. Current Cardiology Reports, 2017, 19(3): 22.

[8] NIIMI M, YANG D, KITAJIMA S, et al. ApoE knockout rabbits: A novel model for the study of human hyperlipidemia [J]. Atherosclerosis, 2016, 245:187-193.

[9] WANG Y, DU Y, SHEN B, et al. Efficient generation of gene-modified pigs via injection of zygote with Cas9/sgRNA [J]. Scientific Reports, 2015, 5:8256.

[10] JINEK M, CHYLINSKI K, FONFARA I, et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity [J]. Science, 2012, 337(6096): 816-821.

[11] KARVELIS T, GASIUNAS G, MIKSYS A, et al. crRNA and tracrRNA guide Cas9-mediated DNA interference in Streptococcus thermophilus [J]. RNA Biology, 2013, 10(5): 841-851.

[12] XU K, REN C, LIU Z, et al. Efficient genome engineering in eukaryotes using Cas9 from Streptococcus thermophilus [J]. Cellular & Molecular Life Sciences, 2015, 72(2): 383-399.

[13] REN C, XU K, LIU Z, et al. Dual-reporter surrogate systems for efficient enrichment of genetically modified cells [J]. Cellular & Molecular Life Sciences, 2015, 72(14): 2 763-2 772.

[14] HAN F R, WANG L, XU K, et al. Development and application of dual-fluorescence reporter systems for measuring specific nuclease activity based on SSA repair mechanism [J]. Hereditas, 2015, 37(10): 1 053-1 060.

[15] BAI Y, HE L, LI P, et al. Efficient genome editing in chicken DF-1 cells using the CRISPR/Cas9 system [J]. G3 (Bethesda), 2016, 6(4): 917-923.

[16] YAN Q, XU K, XING J, et al. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering enhanced by Drosha-mediated sgRNA-shRNA structure [J]. Scientific Reports, 2016, 6:38970.

[17] ZHANG N, JING W, CHENG J, et al. Molecular characterization and NF-kappaB-regulated transcription of selenoprotein S from the Bama mini-pig [J]. Molecular Biology Reports, 2011, 38(7): 4 281-4 286.

[18] UMEYAMA K, WATANABE K, WATANABE M, et al. Generation of heterozygous fibrillin-1 mutant cloned pigs from genome-edited foetal fibroblasts [J]. Scientific Reports, 2016, 6:24 413.

[19] BRZOZOWSKA A, GRIMHOLT U, KULSETH M A, et al. The sequence of porcine apolipoprotein E (APOE) cDNA [J]. DNA Sequence, 1993, 4(3): 207-210.

[20] XIA J, HU B, MU Y, et al. Molecular cloning and characterization of the promoter region of the porcine apolipoprotein E gene [J]. Molecular Biology Reports, 2014, 41(5): 3 211-3 217.

[21] YAZDEKHASTI N, BRANDSCH C, HIRCHE F, et al. Impact of chocolate liquor on vascular lesions in apoE-knockout mice [J]. Clinical Science (Lond), 2017, 131(20): 2 549-2 560.

[22] BANERJEE I, GUPTA V, GANESH S. Association of gene polymorphism with genetic susceptibility to stroke in Asian populations: a meta-analysis [J]. Journal of Human Genetics, 2007, 52(3): 205-219.

[23] HUANG L, HUA Z D, XIAO H W, et al. CRISPR/Cas9-mediated ApoE(-/-) and LDLR-/- double gene knockout in pigs elevates serum LDL-C and TC levels [J]. Oncotarget, 2017, 8(23): 37 751-37 760.

[24] DOENCH J G, HARTENIAN E, GRAHAM D B, et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation [J].Nature Biotechnology, 2014, 32(12): 1 262-1 267.