刀孢蜡蚧菌ZJLP09液体发酵工艺的研究

鹿连明，杜丹超，胡秀荣，蒲占湑，张利平，黄振东，陈国庆(浙江省农业科学院 柑橘研究所，浙江 台州 318020)

柑橘木虱、蚜虫等是柑橘上的重要害虫，目前对于这些害虫的防治仍以吡虫啉、噻嗪酮、毒死蜱等化学农药为主，然而化学农药的频繁使用带来的3R(抗性、再增猖獗和残留)问题日趋严重。而生物农药因具有无残留、特异性强、不杀伤害虫天敌及有益生物、不易产生抗药性、环境相容性好、生产工艺简单等特点越来越引起人们的重视。

在利用生防菌防治柑橘木虱、蚜虫等害虫的研究方面，国内外学者相继开展了一些有益的探索。其中已报道的对柑橘木虱具致病力的真菌有玫烟色拟青霉、白僵菌、檬型被毛孢、宛式拟青霉等[1-5]。已报道的对橘蚜等柑橘蚜虫有致病力的真菌有砖红镰孢菌、弗雷生虫霉菌、蚜虫霉菌等[5-9]。但目前研究多集中在实验室探索阶段，市场上尚无商品化的微生物农药产品可供使用。

刀孢蜡蚧菌ZJLP09为本实验室从浙江台州地区橘园内的柑橘木虱虫体上分离筛选出的1株虫生真菌[10]，经致病性测定，确定该菌株对柑橘木虱和蚜虫具有强致病力，且其对高温、低温、低湿和紫外线等具有更高的抗逆性[11]。为此，本研究通过培养基、温度、pH等条件的优化，建立了一套稳定的适于刀孢蜡蚧菌ZJLP09的液体发酵工艺，以期为进一步开发该菌株的生防菌制剂提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

供试菌株刀孢蜡蚧菌ZJLP09为本实验室从浙江台州地区橘园内的柑橘木虱虫体上分离，接种于马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基(PDA，配方为：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL，自然pH值)上，于4 ℃冰箱保存。

1.2 发酵培养

制备PDA培养基平板，在超净工作台中以无菌接种针挑取斜面上保存的刀孢蜡蚧菌ZJLP09菌块，接种至PDA平板上，之后置于微生物培养箱中28 ℃恒温培养7 d。以无菌打孔器在菌落四周打取菌饼，接种至马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)中，在28 ℃恒温摇床下以转速180 r·min-1震荡培养3 d。

1.3 培养基的筛选

取上述培养的刀孢蜡蚧菌ZJLP09的分生孢子悬浮液，按1%的比例接种到各供试培养基中(表1)，置于28 ℃恒温摇床下以转速180 r·min-1震荡培养，培养不同时间后取样，用血球计数板统计孢子数量， 计算各培养基中菌株ZJLP09的产孢量。

1.4 初始接种量的筛选

取刀孢蜡蚧菌ZJLP09分生孢子悬浮液，按l%、3%、5%、10%和20%的比例(V/V)分别接入装有培养液的250 mL三角瓶中(接种后共100 mL)，每处理设3个重复。置于28 ℃恒温摇床中以转速180 r·min-1的条件下连续振荡培养，培养不同时间后取样，用血球计数板法计算孢子浓度，重复测定3次，取平均值换算成产孢量。

表1 液体摇床培养基及配方

1.5 装液量的筛选

在250 mL三角瓶中分别装入20%、40%、60%、80%的培养液，121 ℃灭菌20 min后，在无菌条件下接入分生孢子悬浮液，接菌量为5%，每处理设3个重复。置于28 ℃恒温摇床中以转速180 r·min-1的条件下连续振荡培养，培养不同时间后取样，用血球计数板法计算孢子浓度，重复测定3次，取平均值换算成产孢量。

1.6 初始pH值的筛选

在250 mL三角瓶中分别装入40%的培养液，将pH分别调至4.0、6.0、8.0、10.0，21 ℃灭菌20 min后，在无菌条件下接入分生孢子悬浮液，接菌量为5%，每处理设3个重复。置于28 ℃恒温摇床中以转速180 r·min-1的条件下连续振荡培养，培养不同时间后取样，用血球计数板法计算孢子浓度，重复测定3次，取平均值换算成产孢量。

1.7 震荡转速的筛选

在250 mL三角瓶中分别装入40%的培养液，将pH调至6.0，接菌量为5%，每处理设3个重复。置于恒温摇床中，28 ℃下分别以100、150、180、200、220 r·min-1连续振荡培养，培养不同时间后取样，用血球计数板法计算孢子浓度，重复测定3次，取平均值换算成产孢量。

1.8 培养时间的筛选

在250 mL三角瓶中分别装入40%的培养液，将pH调至6.0，接菌量为5%，每处理设3个重复。置于恒温摇床中，28 ℃下以180 r·min-1连续振荡培养6 d。每隔24 h从各三角瓶中取培养液，用血球计数板法计算孢子浓度，重复测定3次，取平均值换算成产孢量。

2 结果与分析

2.1 培养基的确定

由表2可知，菌株ZJLP09在不同液体培养基中产孢量存在明显差异。培养3 d后，在沙氏葡萄糖酵母培养基(编号D)中的产孢量最高，含孢量为4.20×108个·mL-1；其次为麦麸培养液(编号J)和马铃薯葡萄糖蛋白胨培养基(编号B)，含孢量分别为3.25×108个和3.15×108个·mL-1；而察氏培养基(编号E)和玉米粉培养液(编号K)产孢量最低，分别仅为3.50×105个和4.00×105个·mL-1。随着培养时间的延长，菌株ZJLP09在多数培养基中的产孢量均明显上升，其在沙氏葡萄糖酵母培养基(编号D)中的产孢量更增加为1.27×109个·mL-1，为所有供试培养基中最高；但其在小米浸液培养基(编号L)和大豆粉玉米粉培养基(编号O)中的产孢量表现为下降，在玉米粉麦麸培养液(编号I)中更难以看到孢子的存在，多生长为菌丝。据此，筛选出适于刀孢蜡蚧菌ZJLP09产孢的最佳液体培养基为沙氏葡萄糖酵母培养基。

表2 菌株ZJLP09在不同液体培养基培养不同时间后的产孢量

注：同列数字后不同小写字母表示在P<0.05水平差异显著。表3～7同。

2.2 初始接种量的确定

在不同接种量条件下，菌株ZJLP09在SDY培养基中的产孢量如表3所示。

表3 在不同接种量条件下菌株ZJLP09在SDY培养基中的产孢量

由表3可知，接种量越大，菌株ZJLP09达到产孢高峰的时间越短。其中培养3 d，20%的接种量条件下菌株产孢量可达5.22×109个·mL-1，而1%接种量条件下菌株产孢量仅为4.35×108个·mL-1。随着培养时间的延长，1%～5%接种量条件下菌株的产孢量明显增加，其中5%接种量条件下在培养7 d后的产孢量可达5.35×109个·mL-1，而此时10%和20%接种量条件下的产孢量已表现下降趋势。究其原因，同一液体培养基下，在通气量等条件一致的情况下，接种量越大，孢子浓度越容易先达到最大。在工业化生产中，为了节约动力消耗，可以增加接种量；为了节约接种量，需增加动力消耗。综合考虑两个因素，可选用5%的接种量用于刀孢蜡蚧菌ZJLP09的发酵。

2.3 装液量的确定

在不同装液量条件下菌株ZJLP09在SDY培养基中的产孢量如表4所示。

表4 不同装液量条件下菌株ZJLP09在SDY培养基中的产孢量

由表4可知，培养相同时间，装液量越少，菌株ZJLP09产孢量越多。在培养3 d和20%装液量条件下，菌株ZJLP09的产孢量可达3.20×109个·mL-1，而80%装液量条件下，菌株的产孢量仅为8.25×108个·mL-1。说明菌株ZJLP09为好氧型菌株，增加通气量(即减少装液量)有利于增加菌株产孢。综合考虑材料利用率和产孢总量，可选用40%的装液量用于刀孢蜡蚧菌ZJLP09的发酵。

2.4 初始pH值的确定

在不同pH条件下菌株ZJLP09在SDY培养基中的产孢量如表5所示。

表5 不同pH条件下菌株ZJLP09在SDY培养基中的产孢量

由表5可知，菌株ZJLP09在不同pH的相同培养基中产孢量差异明显，过酸和过碱都不利于菌株产孢。在pH值5.0～7.0条件下，菌株ZJLP09的产孢量明显高于其他pH条件下，在pH值6.0条件下培养3 d，菌株ZJLP09的产孢量为1.70×109个·mL-1，培养7 d，其产孢量可达5.35×109个·mL-1，而在pH值3.0和pH值10.0条件下培养3 d的产孢量仅为1.20×108个和8.85×107个·mL-1。因此，可选用培养基初始pH值6.0用于刀孢蜡蚧菌ZJLP09的发酵。

2.5 震荡转速的确定

在不同转速条件下菌株ZJLP09在SDY培养基中的产孢量如表6所示。

表6 不同转速条件下菌株ZJLP09在SDY培养基中的产孢量

由表6可知，转速越快，菌株ZJLP09达到产孢高峰所需时间越短。在培养3 d及220 r·min-1转速条件下，菌株产孢量为2.35×109个·mL-1；而在100 r·min-1转速条件下，菌株产孢量仅为7.20×108个·mL-1，在180和200 r·min-1条件下，产孢量无显著差异。综合考虑产孢量和能量消耗等因素，可选用摇床转速为180 r·min-1用于刀孢蜡蚧菌ZJLP09的发酵。

2.6 培养时间的确定

不同培养时间后菌株ZJLP09在SDY培养基中的产孢量如表7所示。

表7 不同培养时间菌株ZJLP09在SDY培养基中的产孢量

由表7可知，菌株ZJLP09随震荡培养时间的延长，呈现先增加再饱和后衰减的趋势。其中培养前5 d菌株的产孢量一直呈递增趋势，至培养第5天产孢量可达5.35×109个·mL-1，与培养第6、7和8天后的产孢量无显著差异，8 d之后菌株产孢量开始下降。因此，可选用培养时间为5 d用于刀孢蜡蚧菌ZJLP09的发酵。

3 小结与讨论

刀孢蜡蚧菌ZJLP09为从浙江台州地区橘园内的柑橘木虱虫体上分离获得的1株虫生真菌，该菌株对柑橘木虱和蚜虫具有强致病力，且对高温、低温、低湿和紫外线等具有更高的抗逆性，表现出良好的开发利用前景。本研究通过对培养基、初始接种量、装液量、pH值、震荡转速和培养时间等方面的筛选优化，确定了刀孢蜡蚧菌ZJLP09产孢所需的最佳条件，建立了一套刀孢蜡蚧菌ZJLP09的液体发酵工艺，具体为：初始接种量5%、摇瓶装液量40%～60%，初始pH值5.0～7.0、震荡转速180～220 r·min-1、培养温度28 ℃、培养时间5 d。

生防菌通常被开发为分生孢子可湿性粉剂等制剂在农业生产中应用，而制剂研制的前提即为制备获得大量高纯度的分生孢子。本研究建立的液体发酵工艺，可获得大量的分生孢子，这为今后刀孢蜡蚧菌ZJLP09分生孢子制剂的研制提供了良好的依据。

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