禽腺病毒4型实时荧光PCR检测方法的建立与应用

杨金兴，张玉霞，李 莉，袁小远(山东省农业科学院 家禽研究所，山东 济南 250023)

禽腺病毒(fowl adenovirus，FAV)根据抗原性差异可以分为3个群，其中Ⅰ群是传统的禽腺病毒，包括从鸡分离到的12个血清型、火鸡2个血清型、鹅3个血清型和鸭2个血清型[1-2]。禽腺病毒可以引起禽包涵体肝炎、心包积液、肌胃糜烂等病变。自2015年6月起，山东省部分地区的肉鸡中爆发了一种以传染速度很快、死亡速度快、死亡率高的传染病，临床以心包积液为主要病变特征[3]。经鉴定，最终确定病原为Ⅰ群禽腺病毒。目前，血清分型表明山东地区流行的禽腺病毒主要是血清4型和8 a/b型，该病毒造成鸡群的死亡率较高，经济损失较大[4-5]。

本研究根据GenBank中的FAV血清4型的基因组序列，在保守区域设计了特异性扩增引物和探针，建立了FAV的实时荧光PCR检测方法，可用于4型FAV样品的实验室检测。

1 材料与方法

1.1 材料

4型FAV分离毒株GF16和WF816由山东省农业科学院家禽研究所分离鉴定。

1.2 方法

1.2.1 引物设计

参照GenBank中FAV的基因组序列，设计引物FAV-FQ-F、FAV-FQ-R、探针P的5’-3序列分别为CTAGGGTTCTGAACTTTG、CGGTAAACATTTCA AGGA和TGACGCCAGTTTCGCTTTCG，探针用FAM和Eclipse荧光染料标记物进行标记。引物及探针均由TaKaRa(大连)公司合成，级别均为HPLC级。

1.2.2 实时荧光PCR

选取鸡FAV分离毒株GF16和WF816进行检测，设血清8型和水作为对照。病毒DNA的提取按照TaKaRa DNAiso试剂操作进行，最后用30 μL超纯水来溶解DNA。

Real-time PCR实时荧光PCR采用Probe qPCR进行，反应体系如下：Probe qPCR 缓冲液12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，探针1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 8.5 μL，共25 μL。反应体系为：95 ℃ 30 s，随后95 ℃ 5 s、55 ℃ 10 s、72 ℃ 20 s进行40个循环，反应结束后观察荧光曲线。同时取5 μL反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检验。以100 bp DNA Ladder的标记物作为参考，TAE缓冲液为电泳缓冲液，电泳30 min，凝胶成像系统观察结果。

1.2.3 临床应用

对42份疑似禽腺病毒感染样品进行上述方法检测，后续进行病毒分离、序列测定等来验证建立的实时荧光PCR的准确性。

2 结果与分析

2.1 实时荧光PCR扩增

禽腺病毒4型的GF16分离毒株和WF816分离毒株实时荧光PCR扩增曲线良好(图1)，2份样品的2个平行样品的Ct值基本一致，为19.3和19.8；阴性对照组未出现扩增曲线。琼脂糖凝胶电泳显示扩增得到预期大小的扩增片段，约150 bp，阴性对照组在此处未出现扩增条带(图2)。

图1 禽腺病毒4型样品的扩增曲线

M为100 bp DNA Laddar Marker；1为样品的PCR扩增条带；2为阴性对照图2 部分样品的电泳结果

2.2 敏感性

将模板DNA进行10倍的倍比稀释，随后同样进行实时荧光PCR进行敏感度的检测。结果表明，本技术的检测最小量可为100拷贝·μL-1。本方法设计合成的双标记荧光探针和引物，扩增曲线良好；电泳结果显示目的条带清晰，说明探针引物性能良好。

2.3 临床应用

对42份疑似禽腺病毒感染样品进行检测后证实，检测到14份阳性样品。经后续的病毒分离、序列测定等证实建立的实时荧光PCR检测法特异性高，该方法可快速灵敏准确地检测禽腺病毒4型，极大地缩短检测时间，同时避免了普通PCR检测出现的的假阴/阳性情况。因此，本研究所建立的探针实时荧光PCR检测技术具有快速、准确、灵敏、重复性好等优点，可用于FAV样品的实验室检测。

3 讨论

本研究建立了可用于检测禽腺病毒4型的特异性方法。本方法特异性强，与其他几种家禽主要疫病病毒(8 a/b型FAV、NDV、H9亚型AIV、IBDV)均无交叉反应，所以建立的实时荧光PCR技术可用于临床检测。

我国主要流行6个血清型的禽腺病毒(火鸡1型、禽1型、4型、5型、8 a/b型)，感染鸡群的发病快、死亡率较高[6-7]。禽腺病毒多存在于禽类的呼吸道和消化道，多数呈隐性带毒，但是一旦机体抵抗力下降就会引起发病，而且往往与其他病毒混合感染，导致死亡率提高[8]。鉴于禽腺病毒的发病特征和近几年来我国的高传播性分布特征，加强本病的快速诊断尤为重要。

参考文献：

[1] PARK H S, LIM I S, KIM S K, et al. Molecular analysis of the hexon, penton base, and fiber-2 genes of Korean fowl adenovirus serotype 4 isolates from hydropericardium syndrome-affected chickens[J]. Virus Genes, 2016:1-6.

[2] KAN F, FUJIMOTO Y, UJINO A, et al.Gallusgalluscoxsackievirus and adenovirus receptor facilitates the binding of fowl adenovirus serotype 1 in chickens[J]. Japanese Journal of Veterinary Research, 2016, 64(3):183-190.

[3] 王娟, 刘亮亮, 李慧昕,等. 禽腺病毒血清4型的分离鉴定及遗传演化分析[J]. 中国兽医科学, 2017(6):755-761.

[4] LI H, WANG J, QIU L, et al. Fowl adenovirus species C serotype 4 is attributed to the emergence of hepatitis-hydropericardium syndrome in chickens in China[J]. Infection Genetics & Evolution, 2016, 45:230-241.

[5] 李晓林, 王相芹, 罗济冠,等. Ⅰ群禽腺病毒的分离鉴定及其致病性研究[J]. 中国动物检疫, 2016, 33(8):86-89.

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[7] 牛登云, 沈元, 王蕊,等. 2015年我国Ⅰ群禽腺病毒分子流行病学调查[J]. 中国家禽, 2016, 38(9):65-68.

[8] 姚克昌, 刘月月, 游国进,等. 西南部分地区Ⅰ群禽腺病毒的分子流行病学调查及致病性研究[J]. 浙江农业学报, 2017, 29(11):1809-1818.