复合酶法优化黄芪多糖的提取工艺研究

邓智月 张乾旭 李婧

（1广东省中医院药剂科 广东 广州 510120）

（2广州中医药第一附属医院科研处 广东 广州 510405）

黄芪（Astragalus membranaceus）为中药中常用的补气药，是豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根[1]。作为一种传统中药材，其含有多种对人体有益的生物成分，例如黄芪皂苷、胡萝卜素、叶酸等[2]。黄芪具有补气升阳，益卫固表，托毒生肌，利水消肿的功效[3]。上能升阳举陷，治疗中气下陷，久泻脱肛等证，下能利水消肿，治疗气虚水肿，内能补气，益卫固表止汗，治疗表虚自汗，外能托毒生肌，治疗痈疽难溃，久溃不敛等。现代药理研究表明，黄芪除了能增强机体免疫功能，还能黄芪有强心、限制或缩小心肌梗死面积，以及改善心肌炎症状、抗应激、抗心肌缺血的作用[4]，能扩张血管，扩张冠脉、降低血压，改善心肌氧的代谢平衡。促进细胞代谢，双向调节血糖浓度。另外，具有抗肿瘤、抗衰老的功能等等[5]。因此，对于黄芪多糖提取与优化，对于进一步探究其药理学作用具有重要意义。

目前，黄芪多糖提取工艺主要有回流提取法、煎煮法、醇水提取法、酶提取法、超声波提取法、微波提取法等[6]。上述提取方法存在耗时耗力、收率低、产物杂质多缺点[7]。本次研究选取具有操作简单、条件温和、提取效率高、环境友好等特点[8-9]酶提取法，通过单因素和L9（34）正交实验设计，以黄芪多糖含量为考察指标，以酶解温度、酶浓度、酶解时间及酶解pH对多糖得率的影响为试验因素，优选黄芪多糖的提取工艺，为黄芪多糖的进一步深入研究提供依据。

1.材料与方法

1.1 试验材料

DK-98-Ⅱ电热恒温水浴锅（天津泰斯特仪器有限公司）；SB-3200DTD超声波清洗器（宁波新芝生物科技有限公司）；UV-1800 紫外可见光分光光度计（日本岛津公司）；R-1001N 旋转蒸发仪（东京理化器械株式会社）；BP211D电子天平（德国赛多利斯公司）；DGH80-B 恒温干燥箱（北京中西远大科技有限公司）。

黄芪购买自北京同仁堂，产地为内蒙古包头；实验中所用蒸馏水均为市售屈臣氏蒸馏水；葡萄糖（天津市凯通化学试剂有限公司，分析纯）；苯酚、浓硫酸（国药集团化学试剂有限公司，分析纯）；中性蛋白酶（酶活力≥100U/mg）、纤维素酶（酶活力≥400U/mg），（大连美仑生物技术有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 标准曲线的绘制 精密称量葡萄糖对照品20mg置于100mL容量瓶中，溶解并稀释至刻度，混匀后即得0.2mg/mL的葡萄糖标准品储备液。精密吸取适量葡萄糖标准品储备液，用蒸馏水分别稀释至0、5、10、20、40、60、80μg/mL，采用苯酚-硫酸法测定多糖浓度。紫外可见分光光度计在490nm下测定其吸光度（A）。按照葡萄糖质量浓度（C）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制线性标准曲线，其回归方程为：A=0.6275C-0.721，R=0.9993。测定多糖质量浓度线性范围是0～80μg/mL。见图1。

图1 标准曲线

1.2.2 样品处理方法 准确称量黄芪药材粉末10.0g，加入复合酶，调节pH，水浴加热。反应结束后，沸水浴10min将酶灭活，抽滤，滤液定容至250mL，作为供试品溶液。按照上述方法测定多糖浓度。

多糖收率（%）=[多糖含量/（1000×黄芪药材粉末质量）]×100

其中多糖浓度单位为μg/mL，黄芪药材粉末质量单位为mg。1.2.3单因素实验设计 采用单因素实验考查，以纤维素酶：中性蛋白酶=1:1的复合酶，考查酶解温度（30、35、40、45、50、55、60℃），酶浓度（4.0%、4.5%、5.0%、5.5%、6.0%、6.5%）、酶解时间（2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5h）和酶解pH（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5）对黄芪多糖提取效果的影响，选择合适的提取条件。

1.2.4 正交试验设计 复合酶法正交试验以酶解温度（A）、酶浓度（B）、酶解时间（C）、酶解pH（D）为试验因素，每个因素下设计3个水平，根据L9（34）正交表安排试验，以黄芪多糖含量为指标，优选黄芪多糖的提取工艺。正交试验因素水平见表1。

表1 正交试验因素水平

2.结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线的绘制

按照葡萄糖质量浓度（C）为横坐标，溶液在490nm处的吸光度（A）为纵坐标，绘制线性标准曲线，其回归方程为：A=0.6275C-0.721，R=0.9993。测定总糖质量浓度线性范围是0～80μg/mL。

2.2 单因素和正交试验结果

单因素结果表明，酶解温度、酶浓度、酶解时间、酶解pH对于黄芪多糖含量均有影响，其中酶解温度小于50℃时，随温度增高，多糖得率增多，温度大于55℃时，多糖得率下降，说明此时酶活性降低。酶浓度在5.5%以下时，得率属于上升状态，而大于5.5%时，复合酶会对黄芪多糖进行分解，降低提取效率。酶解时间大于3.5h时，同样也会使多糖分解。复合酶在偏酸性条件下pH6.0时活性最好。

由表2试验结果可知，对黄芪多糖的提取效果的影响顺序为：酶浓度（B）＞酶解温度（A）＞酶解时间（C）＞酶解pH（D），即复合酶浓度对黄芪多糖的提取效果影响最大，酶解温度次之，酶解时间和酶解pH影响较小。以黄芪多糖的得率为考察指标，4因素3水平最佳酶解提取工艺条件为：酶解温度50℃，酶浓度5.5%，酶解时间3.5h，酶解pH6.0时，其提取效果最佳。在此提取工艺条件下，重复三次进行最优提取条件的验证，黄芪多糖含量占原药材的8.58%，RSD=1.57%（n=3）。结果表明，筛选的最佳提取条件基本稳定，有较好的重复性。

表2 正交实验结果及分析Table.2 Results and analysis of orthogonal test

3.结论

本文通过复合酶法优化提取黄芪多糖工艺，以黄芪多糖含量为考察指标，以酶解温度、酶浓度、酶解时间及酶解pH为试验因素，得到最佳酶解提取工艺条件为：酶解温度50℃，酶浓度5.5%，酶解时间3.5h，酶解pH6.0。在此提取工艺条件下，黄芪多糖含量占原药材的8.58%。利用优化后的复合酶法工艺进行黄芪多糖提取，具有操作不仅简便、快速，而且重复性、稳定性良好等优点，适用于黄芪多糖的规模化提取，为黄芪多糖的进一步深入研究提供依据。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].2015年版.北京:化学工业出版社,2015.

[2]国家食品药品监督管理局药师资格认证中心组织.中药学专业知识.二[M].中国医药科技出版社,2017.

[3]陈国辉,黄文凤.黄芪的化学成分及药理作用研究进展[J].中国新药杂志,2008,17(17):1482-1485.

[4]徐旭，汤立达.黄芪的心血管药理作用研究进展[J].中国新药杂志,2003,12（11）：899-901.

[5]范文彤.黄芪多糖对小鼠免疫功能的药理学实验研究[J].中国当代医药,2018(3).

[6]李海欧,陈琪,林英华,等.正交设计优化黄芪多糖提取工艺[J].畜牧与饲料科学,2018,39(01):1-3.

[7]扎罗,刘振东,王波,等.复合酶法提取西藏金耳粗多糖工艺研究[J].轻工科技,2018(1).

[8]薛燕,敢小双,黄开丽,等.铁皮石斛多糖复合酶法提取工艺及其抗氧化性[J].食品工业科技,2018,39(03):215-219+225.

[9]张宇,马永强,刘晓飞,等.发芽糙米中多糖提取工艺优化及抗氧化研究[J].食品研究与开发,2018(1):30-37.