菠菜霜霉病抗性遗传与育种研究进展

蔡晓锋，王小丽，徐晨曦，葛晨辉，王水，王全华

（上海师范大学生命与环境科学学院，植物种质资源工程技术研究中心，植物种质资源开发协同创新中心，200234）

菠菜（Spinacia oleraceaL.）属于苋科藜亚科菠菜属植物[1]，是世界上一种重要的经济蔬菜作物，是以绿叶为主要产品器官的一、二年生草本植物。菠菜起源于波斯地区（今伊朗及周边），于公元647年传入中国，被称为波斯菜。由于其生长迅速并且耐低温，可以越冬栽培，在世界上许多国家均有种植。根据联合国世界粮农组织统计数据，2016年世界上菠菜产量约为2 668.4万t（59个菠菜生产国数据），其中菠菜的生产主要集中在中国，约为2 448.5万t，占世界总产量的91.8%；并且菠菜产量在中国蔬菜产量排名中位于第7位，占中国蔬菜总产量的4.21%，中国是世界上最大的菠菜种植国家及消费国家（http://www.fao.org/faostat/en/#data）。

菠菜是一种重要的深绿色叶用蔬菜，具有很高的营养价值，并逐渐被列入健康饮食菜单[2]。菠菜叶片含有丰富的β-胡萝卜素、叶酸、叶黄素、维生素B、维生素K、维生素E和维生素C；同时富含钙、磷、钠和钾等矿物质元素；另外新鲜叶片中还含有丰富的抗氧化剂，是氧自由基吸收能力活性最高的蔬菜之一[3，4]。近几年来，随着生活水平的提高，人们对菠菜产品的消费量越来越大，同时对菠菜产品的营养和品质也提出了更高的要求，另外在长期、大面积的生产过程中，菠菜病害也随之发展，为害加重，尤其是霜霉病的大面积暴发，给种植者造成重大的损失，无法满足市场供应，因此选育营养丰富、抗病的优良新品种是解决此问题的关键。而收集种质资源、筛选鉴定菠菜抗病相关基因是进行菠菜抗病育种的前提和基础。本文从菠菜种质资源的收集、抗性遗传与育种、分子标记及抗性机理等方面，综述了菠菜抗病遗传育种的研究进展，以期为菠菜抗病育种提供参考。

1 菠菜霜霉病及抗性种质资源

菠菜生产中的主要病害是霜霉病和白锈病等，尤其以霜霉病最为严重。菠菜霜霉病是由专性病原体（Peronospora farinosaf.sp.spinaciae，Pfs）引起的气传病害[5]，主要为害植株叶片，苗期和成株期均可发生，在世界范围内广泛流行，是菠菜上的毁灭性病害。

菠菜栽培历史悠久、地域分布广、种质资源丰富，具有1个栽培种和2个野生型（S.turkestanica和S.tetrandra），国内外的科研机构对菠菜种质资源进行了广泛收集。据荷兰遗传资源中心Kik博士[6]报道，荷兰遗传种质资源中心（CGN）保存菠菜种质资源（包括野生种）387份，中国国家作物种质库保存菠菜种质资源326份，美国农业部（USDA）保存菠菜种质资源301份，其他国家的科研机构也保存着大量的菠菜种质资源，共计1 938份。自20世纪50年代始，我国的蔬菜科研单位就开始了菠菜种质资源的收集鉴定工作，目前已从我国27个省、市和其他3个国家共搜集入国家作物种质库保存的菠菜种质资源333份[7]，丰富的菠菜种质资源为后期进行菠菜抗病育种提供基础。

2 菠菜霜霉病抗性遗传及育种

尽管菠菜霜霉病抗性遗传规律和抗性机制仍不明确，然而育种家们通过田间抗性鉴定，筛选抗性材料，培育出一系列的抗病品种。菠菜霜霉病菌首次报道是在1800年，但在1991年之前才鉴定出4个菠菜霜霉病菌生理小种[8]。在发现菠菜霜霉病生理小种3之前，一直认为菠菜霜霉病对生理小种1、2的抗性受1个显性基因控制，而在发现该生理小种3后，发现菠菜霜霉病抗性基因受到2个连锁的基因控制。国外的育种家针对这些生理小种筛选抗病资源，培育出抗病一代杂种，如Califlay、Dixie Market、Mazurka、Polka、Bolero 和 Bossanova 等[2]；而在接下来的20 a间则鉴定出10个霜霉病菌生理小种，并且发现部分新的生理小种对所有已知的遗传抗性免疫[9，10]，育种家们针对这些新的生理小种寻找新的抗原，并培育出新的抗病品种，如El Dorado、El Palmar、Emilia、Lazio 和 Lombardia 等可以抗 1～10号生理小种。到目前为止，已经分离鉴定出16个菠菜霜霉病生理小种[2，11，12]，为针对不同地区不同生理小种进行有目的的抗病育种工作奠定了基础。

表1 菠菜霜霉病抗性位点、所抗生理小种及连锁的遗传标记

我国对菠菜霜霉病的研究则相对滞后，只有少量研究报道对我国存在的菠菜霜霉病菌生理小种进行分离鉴定，仅有范桂彦等[13]对5份采集于北京、山东、山西的霜霉病样品进行菠菜霜霉病菌生理小种鉴定，尚未见其他关于菠菜霜霉病菌生理小种鉴定的报道[13]。目前仍主要通过田间鉴定法进行抗霜霉病菠菜品种选育如沪菠1号的选育[14]，和不同品种的比较试验[15]等。在一些抗白锈病品种的推广过程中，发现有些品种对霜霉病也表现田间抗性，但是具体的抗性遗传机制还不清楚[2]。

我国菠菜生产中使用的抗霜霉病品种主要来自国外种子公司。这些国外抗病品种的大量推广和单一使用，进一步造成霜霉病菌的扩散和快速进化，致使我国菠菜霜霉病菌生理小种急剧增加，常导致已经大量推广应用的抗病品种不再抗病[16]。因此，培育抗病能力更强、适应范围更广的菠菜新品种已成为目前抗病育种工作中急待解决的问题。

3 菠菜抗霜霉病分子标记及抗性机理研究

菠菜霜霉病抗性的鉴定主要是通过检测病原菌的致病性，但是该方法耗时、耗力并且需要特定的环境条件进行病原菌的接种、筛选和鉴定，该过程控制不当极易引起霜霉病病原菌扩散。因此，筛选开发与霜霉病抗性位点或基因连锁的分子标记，是更有效、更便捷的选育抗霜霉病新品种的方式。

Irish等[17]通过4次轮回回交，以抗病材料Lion和感病材料Viroflay为亲本构建菠菜霜霉病抗性（生理小种6）近等基因系（NIL1）。根据分离群体分析发现，该菠菜霜霉病抗性是由一个显性基因控制，并将此抗性位点命名为Pfs-1。利用群体分离分析 （Bulk segregant analysis） 鉴 定 一 个 AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism）标记与Pfs-1位点连锁，用该连锁位点开发了一个共显性SCAR（Sequence Characterized Amplified Region）标记，这个SCAR标记与单显性基因控制位点Pfs-1紧密连锁（约1.7 cM），命名为Dm-1（表1）。通过对123个品种检测，Dm-1标记可以正确区分120个品种的抗病表型；此外，包含Pfs-1位点的近等基因系抗多个霜霉病生理小种，说明Pfs-1位点可能包含抗性基因簇[9]。

前期霜霉病抗性鉴定结果认为，霜霉病抗性受6个位点的控制[9，17]。因为霜霉病生理小种命名时经常采用Pfs或Pf缩写，而第一个鉴定的霜霉病抗性位点也被命名为Pfs-1[17]，所以极容易造成混淆。为了便于区分将6个菠菜霜霉病抗性位点重新命名为 RPF1 ～RPF6 （Resistance againstPeronospora farinosa），RPF1即前期鉴定的Pfs-1位点，而其2个等位基因被分别命名为RPF1-1（显性基因）和RPF1-2（隐性基因）[2]。含有RPF2抗性位点的菠菜可以抗1～10号生理小种，而11号生理小种可以克服菠菜品种对1～10号生理小种的抗性，但包含RPF1，RPF3和RPF6抗性位点的菠菜可以抗11号生理小种；生理小种12可以侵染含有RPF1和RPF2的菠菜品种，RPF3位点可以抗12号生理小种。13号生理小种可以克服RPF2和RPF3抗性位点对菠菜的保护，而包含RPF1位点的菠菜可以高效抵抗13号生理小种侵染。14号生理小种与12号生理小种相似，能够引起相同的病态反应，可以通过一些新的感病品种Pigeon、Cello和Celesta对它们加以区分[18]。

Feng等[19，20]利用新一代测序技术对菠菜霜霉病病原菌12、13、14号生理小种进行基因组测序，鉴定了1 000个左右简单重复序列（SSR）和9 000个SNP位点，并根据霜霉病病原菌UA0510C的Pfs基因组测序结果，筛选出48对SSR引物，检测了6、10、11、12、13、14 号生理小种；结果表明，48 对引物可以扩增出Pfs基因片段，其中4对引物还可以扩增其他同类的病原菌基因；另外有32对引物在Pfs基因扩增片段中具有多态性，并且部分引物鉴定出一些杂合位点，表明该位点属于杂合抗性。Shi[21]利用 GBS（genotyping by sequencing）技术对 462 个菠菜基因型测序，获得475 000 SNPs，通过关联分析筛选出4个与菠菜霜霉病紧密连锁的SNP标记。虽然抗霜霉病分子标记取得了一些进展，为培育抗病品种提供了分子依据，但相关抗性基因克隆还未见报道，菠菜抗霜霉病机理仍不明确。

4 菠菜抗性相关基因研究进展

尽管菠菜中6个与霜霉病抗性相关的位点尚未克隆或鉴定，但在拟南芥中霜霉病抗性机制的研究报道也有很多，可为研究菠菜霜霉病抗性机制提供良好的支持。到目前为止，已鉴定出28个不同的拟南芥霜霉病抗性基因（Recognition ofPeronospora parasitica，RPP）[22]，并且其中一些基因已被克隆和功能分析，如 RPP1、RPP5 和 RPP13[23～25]。 所有克隆的RPP基因均属于植物抗性基因（Resistance，R）家族，NBS-LRR类亚家族 （Nucleotide binding siteleucine-rich repeats）。此外，许多RPP基因定位于MRCs（Major recognition gene complexes）基因位点上，如RPP5位点包含7个TIR-NBS-LRR类R基因，3个相关序列和2个非R基因[26]。而菠菜RPF1位点对多个霜霉病生理小种的抗性可能与RPP5位点相似，均含有多个抗性基因，对菠菜快速适应和抵御多变的病原菌生理小种具有重要意义。

Bai等[27]在菠菜中克隆并鉴定了一个病程相关蛋白基因SoPR10；Feng等[28]通过对不含抗霜霉病位点、含有1个和2个霜霉病位点菠菜品种进行转录组测序，在菠菜品种Viroflay和Califlay之间发现上百个NBS-LRR抗病基因，同时也鉴定出一些病程相关蛋白基因如几丁质酶基因（Classes I to IV）。此外还发现1 800 SSRs，超过 6 000个SNPs，为分子标记开发利用提供基础。Xu等[29]通过对菠菜栽培种进行全基因组测序，在菠菜基因组中鉴定筛选出139个NBS-LRR基因，并且结合Irish等[17]对霜霉病生理小种6抗性基因定位结果，将标记Dm-1定位到第三条连锁群上，在Dm-1标记附近发现5个NBS-LRR候选基因，其中2个NBS-LRR候选基因为串联重复基因。折红兵等[30]利用同源序列克隆的方法，从菠菜基因组中克隆到22个NBS-LRR类抗病基因[30]。这些研究为进一步克隆抗病基因及研究菠菜的抗病机理奠定坚实基础。

5 菠菜抗性育种工作面临的问题

尽管我国很早就开始了菠菜种质资源的收集工作，但缺乏对资源系统的整理和鉴定，导致很多优良的种质资源在菠菜育种中无法被有效利用，尤其是在菠菜抗霜霉病的种质资源的筛选、鉴定及利用方面与国外相比存在较大的差距。目前我国的菠菜抗病育种研究缺乏抗病种质材料、抗病鉴定方法和先进的育种手段。因此，广泛收集及整理国内外的菠菜种质资源，筛选针对不同地区的抗霜霉病菠菜种质资源，加强分子生物学手段辅助育种及抗病机理研究，筛选抗病材料，从而培育出抗病品种，是解决菠菜病害的有效途径。

6 展望

分子标记辅助选择育种是将分子标记应用于作物品种改良过程中进行选择的一种辅助手段，可以减少连锁累赘，获得期望的个体，达到提高育种效率的目的，但在菠菜中该技术应用的较少。当前针对分子技术的研究也仅局限在菠菜性型基因和抗霜霉病基因的定位上，已筛选到的分子标记多为AFLP标记，其应用有很大的局限性，并且还不能应用于准确鉴定菠菜的性型和抗性。目前随着菠菜参考基因组测序和转录本测序的完成及高密度遗传连锁图谱的构建和完善，将会对开发分子标记，进行抗性基因精细定位和克隆提供支撑，同时也为分子标记辅助选择育种奠定坚实的基础，将大大促进菠菜抗性育种的研究进程。

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