儿童复发性腮腺炎患者与正常儿童腮腺液微生物群落多样性的差异

李 莹 祁森荣 华 琳 尚佳健*

(1.首都医科大学附属北京口腔医院儿童口腔科， 北京 100050；2.首都医科大学附属北京口腔医院放射科， 北京 100050；3.首都医科大学生物医学工程学院数学与生物信息教研室，北京100069)

儿童复发性腮腺炎(juvenile recurrent parotitis，JRP，以下简称儿复腮)是发生于儿童腮腺的感染性疾病，发病率仅低于流行性腮腺炎。目前临床的治疗方法，特别是在急性期，主要采取应用广谱抗生素治疗，尚无针对性的抗炎治疗方法[1]。儿复腮病因复杂，发病机制目前尚不十分清晰，可能与以下因素有关：细菌或病毒逆行性感染、导管系统发育异常、遗传因素、自身免疫性疾病、变态反应等，其中细菌感染是最主要的原因之一[2]。目前对儿复腮的细菌学研究主要使用培养法，而其中一部分微生物，很难或者不能通过传统的纯培养分离方法得到。近年来，随着分子生物学技术的发展，从基因学角度探索口腔微环境的组成和结构，使越来越多的未培养微生物得以检测。16SrRNA克隆测序法，为各种微环境中许多未知菌种的鉴定与分析提供了非培养依赖的方法。近年来该技术已作为一项新技术逐渐引入到口腔微生物系统分析中，如牙周病、感染根管的细菌分析。但国内尚未见该方法用于儿复腮的细菌学检测中的相关报道。本研究对儿复腮患儿的腮腺液进行微生物学检测，并分析与正常儿童的差异，有助于了解其病因及发病机制，为寻找针对性治疗方法提供参考。

1 对象与方法

1.1 研究对象

随机选取2015年11月20日至2017年3月10日在首都医科大学附属北京口腔医院颌面外科涎腺中心就诊的儿复腮患者35例为疾病组(JRP组)，以及在儿童口腔科就诊的无腮腺肿胀史的牙体疾病患者12例为对照组(normal children，NC组)。47名受试者中，男性30例，女性17例，年龄3～12岁，平均6.1岁。其中一部分患者取双侧腮腺液样本(2个样本)，一部分患者取单侧腮腺液样本(由于患儿配合程度和发病程度有差异)，共获得60个临床患者样本，2例为空白对照样本，操作方法相同但不收集唾液。

病例组纳入标准：1)3～12岁儿童，腮腺反复肿胀(同一部位腮腺肿胀超过一次)或导管口有脓性分泌物(单侧或双侧)者。2)腮腺造影表现为导管末梢点球状扩张或腮腺超声表现为腺体内点状或窦状低回声区。3)血常规检查结果显示白细胞数增高，淋巴细胞正常者。

正常对照组纳入标准：患儿年龄3～12岁。腮腺无肿胀史。排除标准：1)治疗依从性差或伴有严重的全身性疾病者。2)确诊为流行性腮腺炎患儿。3)腮腺只肿胀过一次，无法确诊的。

符合要求的病例经患儿及家长知情同意，并由家长签署《知情同意书》后纳入本研究。

1.2 临床检查

收集每一位患儿的以下临床资料：姓名、性别、出生日期、联系方式、全身疾病情况、抗生素服用情况、主诉、现病史、专科检查、影像学检查结果、诊断及治疗史、取材情况、采集人等。

1.3 样本采集

各组儿童腮腺导管口周围直径2 cm范围内安尔碘消毒，在导管口处放置无菌消毒小棉粒，直径约0.5 cm，于口外用手按摩腮腺区，并从耳后向前挤压至腮腺导管口处，使挤出的腮腺液完全浸润小棉粒。取出小棉粒放入无菌试管内，-80 ℃冰箱保存。

1.4 提取样本中DNA，扩增样本16SrRNA V3-V4区

利用340F (5′-CCCTAYGGGGYGCASCAG-3′)[3]和805R (5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′)[4]引物对对样本微生物16SrRNA V3-V4区进行PCR扩增。

1.5 文库构建、上机测序和Alpha多样性指标

使用Illumina Hiseq 2500 PE250高通量测序平台(北京诺赛基因组研究中心有限公司)对扩增成功样本的16S-rRNA V3-V4区进行测序得到原始数据，对原始数据进行拼接过滤得到有效数据，根据97%的相似性水平对有效数据进行归类，得到多个序列聚类操作分类单元(operational taxonomic units, OTUs)。利用QIIME[5]软件包中的uclust[6]聚类方法将移除嵌合体后的序列归为多个OTUs，得到OTU分组情况。然后基于SILVA参考数据库，利用RDP Classifier[7](采用confidence cutoff=0.8)对每个样品的OTUs进行分类学(Taxonomy)注释，并对OTUs进行生物信息分析。

以随机抽取序列数为40 000提取Alpha多样性指标，包括样品文库的覆盖率(goods_coverage)、丰富度指数(包括Chao1[8]与菌群丰富度指数(abundance coverage estimator,ACE)、多样性指数(包括Shannon等[9]与Simpson[10])、observed_species等。

1.6 统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件进行统计分析。儿复腮患者与正常儿童腮腺液的Alpha多样性指标的组间比较采用两独立样本t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 样本扩增情况

对62个样本进行DNA提取、扩增，其中50例样本扩增成功(JRP组34例，NC组16例)，12个样本(包含2个空白对照样本)扩增未成功。扩增成功的50个样本总共获得 7 303 281条有效数据，平均读长为459个碱基。共得到 19 399个OTUs。

2.2 稀释性曲线(rarefaction curve)

各样本的稀释曲线(图1)大多趋于平缓，表明大部分物种已经被检测到，实验得到的数据可用于后续分析。

2.3 Alpha多样性指标计算

统计分析结果显示，在丰富度指数(Chao1)、多样性指数(Shannon与Simpson)中，除了Simpson两组比较没有统计学意义，其他指标组间差异均有统计学意义(P<0.001)，详见图2～4和表1。

图1 各样本稀疏曲线Fig.1 The rarefaction curve of samples

The rarefaction curves of most samples tended to be flatten, which indicates that most of species hade been detected and the obtained data could be used for further analysis.

图2 各样本Chao1曲线Fig.2 The Chao1 curve of samples

The difference of Chao1 between the disease group and normal group was statistically significant (P<0.001)

图3 各样本Shannon指数曲线Fig.3 The Shannon Index Curve of Samples

The curve of each sample tends to be smooth and reach saturation, which indicates that the sequencing quantity of this experiment can basically reflect the diversity of microflora. In this study, the difference of Shannon index between the disease group and normal group was statistically significant (P<0.01).

图4 simpson指数曲线Fig.4 The Simpson index curve of samples

There was no significant difference between the disease group and normal group.

表1 儿童复发性腮腺炎患者与正常儿童腮腺液的Alpha多样性指标比较Tab.1 Comparison of Alpha diversity in parotid fluid between JRP and the normal children index

2.4 微生物构成的丰度排序(属水平)

JRP组按丰度高低排名前5位的微生物为：链球菌属、嗜血杆菌属、 奈瑟氏菌属、孪生球菌属、氏菌属。NC组的排序为：链球菌属、嗜血杆菌属、孪生球菌属、奈瑟氏菌属、罗氏菌属。

3 讨 论

在本研究中，12个样本扩增未成功。其中2例空白样本均未扩增成功，可以说明获取样本方法可靠，没有可检测出来的生物污染。另外10个样本(JRP组2例，NC组8例)未扩增成功的原因可能是腮腺液内微生物含量低或者是取样本时所获得的腮腺液较少。

口腔是消化道的起始端，口腔微生物群落是指定植于人体口腔的微生物集合[11]。2008年人类口腔微生物组数据库(the human oral microbiome database, HOMD)正式启动，该数据库主要建立在16SrRNA检测的基础上，记录了13门619种口腔微生物的分类[12]。徐欣等[13]通过收集不同年龄、不同牙列阶段的临床样本进行细菌学检测，结果显示人群中口腔微生物的分布模式差异存在统计学意义；随着年龄改变，口腔细菌在“门”水平呈现动态改变；婴儿口腔内的微生物多样性较成人低。腮腺结构和功能存在个体差异，腮腺导管开口于口腔内，口内微生物可进入腮腺导管系统。不同个体腮腺微生物是否具有多样性差异，相关研究较少。本实验通过研究口腔生物群落的多样性，希望深入理解口腔微生物与疾病之间的相互作用关系。

人体口腔微生物群落的稳定是指不同种群间达到动态的生态平衡的结果[14]。当口腔微生物群落与宿主处于平衡状态时，发挥屏障作用，阻止外源性致病菌的入侵；当平衡状态被破坏时，可能会发生口腔疾病[15]。口腔微生物还可作为病灶，与全身系统性疾病关系密切。Becker等[16]对龋病微生物多样性进行研究，发现多种细菌的组成和结构在龋病患者与无龋人群之间差异有统计学意义, 国内研究[17]也有相同结论。临床研究[1]显示儿复腮患儿的腮腺肿胀发作与上呼吸道感染等疾病相关，目前普遍认为微生物是从口腔逆行进入腮腺导管系统，导致腮腺炎性反应的发生。本研究显示正常儿童腮腺内有复杂的微生物环境。儿复腮患儿腮腺液中丰度较高的细菌都可以在正常儿童腮腺内发现，说明儿复腮可能是由条件致病菌参与的感染性炎性反应，而且致病菌可能并非是在患病时由口腔内逆行进入腮腺内的。

本研究把儿复腮患者与正常儿童腮腺液两组样本的微生物群落分别作为一整体，研究两组之间的Alpha多样性指标的差异。Alpha多样性指标包括：Goods-coverage、丰富度指数(Chao1与ACE)、多样性指数(Shannon与Simpson)、Observed_species等。其中Goods_coverage表示各样品文库的覆盖率，本实验中各样本的覆盖率均达到97%以上；丰富度指数衡量样本中物种种类个数；多样性指数用来衡量微生物群落的异质性，其中ACE是用来估计群落中含有 OTU 数目的指数；Observed_species表示样品中OTU的个数。本研究结果表明儿复腮患者组中微生物群落的丰富度、多样性低于正常儿童组。提示儿复腮不仅仅是单一菌种感染致病，而是腮腺内原有条件致病菌占比增多造成生态关系失衡的结果[18]。

采用广谱抗生素全身治疗，可能会进一步干扰菌群关系的平衡。李琰[19]的研究显示中药长皮膏在治疗慢性下肢静脉性溃疡中疗效显著，分析机制可能是治疗增加了创面菌种的多样性，通过竞争性生长，弱化致病菌的致病作用，促进溃疡面的愈合。儿复腮临床治疗中碘化油导管灌注的临床效果较好，原因可能是碘化油为广谱抑菌剂，有利于抑制致病菌，恢复正常菌群环境[20]。因此儿复腮的治疗策略需要将患儿与微生物群落作为一整体加以考虑，以恢复或重建适宜的腮腺微生态环境为目标。

微生物群落的失衡是导致口腔多种感染性疾病的重要因素，如龋病[21]、牙周疾病[22-23]等，本研究提示儿复腮也具有相同机制。治疗策略及预防复发以恢复或重建的腮腺微生态环境为目标。儿复腮患者腮腺内菌群失衡的机制及主要致病菌的构成、丰度等仍需进一步研究。

[1] 谢李松.儿童复发性腮腺炎病因学研究及治疗进展[J].中国实用口腔科杂志,2012,5(12):759-762.

[2] Brook I. The bacteriology of salivary gland infections[J]. Oral Maxillofac Surg Clin North Am, 2009, 21 (3):269-274.

[3] Gantner S, Andersson A F, Alonso-Sáez L, et al. Novel primers for 16S rRNA-based archaeal community analyses in environmental samples[J]. J Microbiol Methods, 2011 ,84(1):12-18.

[4] Herlemann D P, Labrenz M, Jürgens K, et al. Transitions in bacterial communities along the 2000 km salinity gradient of the Baltic Sea[J].ISME J, 2011 ,5(10):1571-1579.

[5] Caporaso J G, Kuczynski J, Stombaugh J, et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data[J]. Nat Methods, 2010, 7(5): 335-336.

[6] Edgar R C, Haas B J, Clemente J C, et al. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection[J].Bioinformatics，2011,27(16):2194-2200.

[7] Wang Q, Garrity G M, Tiedje J M, et al. Naivebayesian classifier for rapid assignment of rrnasequences into the new bacterial taxonomy[J]. Applied and environmental microbiology, 2007,73(16):5261-5267.

[8] Chao A. Non-parametric estimation of the number of classes in a population[J]. Nat Methods,1984,11(4):265-270.

[9] Shannon C E, Weaver W. A mathematical theory of communication[J]. Bell Sys Technic J, 1948,27(4): 379-423.

[10] Simpson E H. The Measurement of diversity[J]. Nature, 1949, 163(4148):688.

[11] Dewhirst F E, Chen T, Izard J, et al. The human oral microbiome[J]. J Bacteriol, 2010,192(19): 5002-5017.

[12] 何金枝,徐欣,周学东.口腔微生物与全身健康研究进展[J].微生物与感染,2017,12(3):139-145.

[13] 徐欣,何金枝,周学东.口腔微生物群落在口腔与全身疾病预警中的作用[J].华西口腔医学杂志,2015,33(6):555-560.

[14] Merritt J, Kreth J, Shi W, et al. LuxS controls bacteriocin production in Streptococcus mutans through a novel regulatory component [J]. Mol Microbiol,2005,57(4):960-969.

[15] 施文元，周学东.人体口腔微生物群的相互作用[J].华西口腔医学杂,2010,28(1):1-4.

[16] Becker M R，Paster B J，Leys E J，et al. Molecular analysis of bacterial species associated with childhood caries[J].J Clin Microbiol，2002，40(3)：1001-1009.

[17] 李志艳,赵翀,刘静,等.青海汉族和藏族高龋患者口腔微生物多样性差异研究[J].牙体牙髓牙周病学杂志,2017,27(5):250-253,265.

[18] Papadopoulou-Alataki E, Chatziavramidis A, Vampertzi O, et al. Evaluation and management of juvenile recurrent parotitis in children from northern Greece[J]. Hippokratia, 2015, 19(4):356-359.

[19] 李琰.中药长皮膏对慢性下肢静脉性溃疡的微生态调控作用的研究[D].上海： 上海中医药大学,2015:1-140.

[20] Roby B B, Mattingly J, Jensen E L, et al. Treatment of juvenile recurrent parotitis of childhood:an analysis of effectiveness[J]. JAMA Otolaryngol Head Neck Surg, 2015, 141(2):126-129.

[21] 王少果,游祥磊,车春晓,等.16SrRNA高通量测序研究有龋者唾液微生物群落结构及多样性[J].口腔医学研究,2015,31(5):461-465.

[22] 陈慧.口腔微生物组的结构分析及与疾病的关系研究[D].上海：上海交通大学,2016:1-189.

[23] 许志亮. 非手术根管再治疗-根尖手术联合治疗难治性根尖周炎[J].首都医科大学学报，2015，36(3)：478-482.