舌鳞状细胞癌组织中Oct4、Sox2蛋白表达变化及意义

陈宏丽，柴菲，尹刚，杨敬，任晓俊(山西医科大学汾阳学院，山西汾阳0300；山西医科大学附属汾阳医院)

舌鳞状细胞癌(TSCC)是最常见的口腔癌，其特点为恶性程度高、浸润性生长、早期发生淋巴结转移[1]。TNM分期可对治疗前肿瘤范围及转移进行评估，但对TSCC的评估有局限性。因此亟需寻找新的生物学及临床标志物对TSCC进行评估[2]。转录因子Oct4、Sox2被认为是胚胎干细胞转录调控的核心[3]，Oct4、Sox2与肿瘤干细胞(CSC)密切相关，表达Oct4、Sox2的肿瘤细胞有类似CSC的表现[4]。Oct4、Sox2在人类恶性肿瘤的发生中发挥重要作用，而在异种移植肿瘤中敲除Oct4与Sox2基因可抑制肿瘤的形成[5]。研究表明，Oct4在生殖细胞瘤、乳腺癌、宫颈癌、口腔癌、前列腺癌、肺癌、胃癌、肝癌、卵巢癌等组织中过表达[6]；且Oct4与CSC的活性和功能密切相关[7]。Sox2在肺癌、乳腺癌、结肠癌、黑色素瘤、卵巢癌、脑肿瘤等肿瘤组织中高表达[8]；其与肿瘤细胞的增殖活性、生长、转移和不良预后相关[9]。目前TSCC发生的机制尚不清楚。本研究检测Oct4、Sox2在TSCC组织中的表达，旨在为TSCC患者的临床治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2007年12月～2012年1月山西医科大学附属汾阳医院颌面外科手术切除的TSCC组织标本83例。患者男60例、女23例，年龄29～82(48.42±3.29)岁；WHO分类系统组织学分级为Ⅰ级38例、Ⅱ级32例、Ⅲ级13例；采用2010年国际抗癌联盟指南进行TNM分期，Ⅰ期30例、Ⅱ期30例、Ⅲ期15例、Ⅳ期8例；有淋巴结转移25例，无淋巴结转移58例。患者入选标准：①其病理组织标本经4%甲醛液固定，常规石蜡包埋，保存完整；且临床资料、病理资料完整。②术前未接受放化疗，以手术治疗为初次治疗。③原发于舌部，临床与病理检查均确诊为TSCC。排除标准：远处转移。另选15例舌部非肿瘤手术患者舌正常黏膜组织作为对照。患者男12例、女3例，年龄25～78(46.58±2.96)岁。两者性别、年龄具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准，参与者均签订知情同意书。

1.2 组织中Oct4、Sox2蛋白表达检测 采用免疫组化SP法。石蜡标本常规连续切片(厚度2 μm)，脱蜡水化，用3% H2O2封闭10 min，PBS缓冲液浸泡，放入含EDTA的沸水中加热行抗原修复，冷却至室温，滴加一抗(Oct4的一抗浓度为1∶100、Sox2的一抗浓度为1∶200，各1～2滴)，4 ℃冰箱过夜；PBS清洗后滴加羊抗鼠IgG聚合物二抗，DAB显色液显色，苏木素复染，乙醇缸脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。以已知阳性切片作为阳性对照，以PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。由2名经验丰富的主治医师行独立双盲法阅片。结果判定：Oct4定位于细胞核，Sox2定位于细胞质，以出现棕黄色至深棕黄色颗粒为阳性。根据着色程度、阳性细胞百分比进行评分。着色为棕褐色计3分，棕黄色计2分，淡黄色计1分，基本不着色计0分；阳性细胞百分比>75%计4分，50%<阳性细胞百分比≤75%计3分，25%<阳性细胞百分比≤50%计2分，阳性细胞百分比≤25%计1分，阳性细胞百分比为0计0分。将以上两项得分相加，计算总分(0～7分)，0～1分为表达阴性，2～7分为表达阳性。鼠抗人Oct4单克隆抗体及鼠抗人Sox2单克隆抗体均购自美国Santa Cruz Biotechnology Inc；快捷型酶标羊抗鼠IgG聚合物、DAB显色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。

1.3 统计学方法 采用SPSS20.0统计软件。计数资料组间比较采用χ2检验。对患者随访5年，记录生存人数。生存影响因素采用COX比例风险回归进行单因素、多因素分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TSCC组织和舌正常黏膜组织中Oct4、Sox2蛋白表达比较 TSCC组织和舌正常黏膜组织中Oct4蛋白阳性表达率分别为87.95%(73/83)、13.33%(2/15)，二者比较差异有统计学意义(P<0.05)；TSCC组织和舌正常黏膜组织中Sox2蛋白阳性表达分别为93.98%(78/83)、26.67%(4/15)，二者比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 Oct4、Sox2蛋白表达与TSCC患者临床病理参数的关系 Oct4、Sox2蛋白阳性表达均与患者年龄、性别、吸烟史、饮酒史、肿瘤临床分期无关(P均>0.05)，与肿瘤组织学分级、淋巴结转移有关(P均<0.05)。见表1。

2.3 Oct4、Sox2蛋白表达与TSCC患者生存率的关系 随访5年，83例患者生存48例，生存率为57.83%(48/83)。其中73例Oct4蛋白阳性表达的患者存活40例，5年生存率为54.79%(40/73)；10例Oct4蛋白阴性表达的患者存活8例，5年生存率为80.00%(8/10)；二者比较差异有统计学意义(P<0.05)。78例Sox2蛋白阳性表达的患者存活44例，5年生存率为55.13%(44/78)；5例Sox2蛋白阴性表达的患者存活4例，5年生存率为80.00%(4/5)；二者比较差异有统计学意义(P<0.05)。68例Oct4与Sox2蛋白同时阳性表达的患者存活21例，5年生存率为30.88%(21/68)；4例Oct4和Sox2蛋白同时阴性表达的患者存活3例，5年生存率为75.00%(3/4)；二者比较差异有统计学意义(P<0.05)。25例有淋巴结转移患者存活5例，5年生存率为2.00%(5/25)；58例无淋巴结转移患者存活43例，5年生存率为74.14%(43/58)；二者比较差异有统计学意义(P<0.05)。单因素分析：以83例患者为样本，以患者的生存状态为应变量，赋值：死亡(1)、生存(0)、生存期(t)，以表1所列各临床病理参数为自变量，逐一建立COX比例回归模型。结果显示，年龄、性别、吸烟、饮酒、肿瘤组织学分级及临床分期与患者总生存率无关(P均>0.05)；Oct4、Sox2蛋白表达及淋巴结转移均与患者总生存率有关(P均<0.05)。见表2。多因素分析：建立多因素COX比例风险回归模型，回归过程采用后退法，设定α退出=0.05，进行自变量的选择和剔除。结果，Sox2、淋巴结转移两个因素均被保留入回归方程(P均<0.05)，提示二者为TSCC患者5年生存率的影响因素。见表3。

表1 Oct4、Sox2蛋白阳性表达与TSCC患者临床病理参数的关系(例)

表2 TSCC患者5年生存率影响因素单因素分析

表3 TSCC患者5年生存率影响因素多因素分析

3 讨论

TSCC是最常见的口腔癌类型，近几年发病率居高不下。目前经手术及放化疗等治疗后患者生存率仍无明显提高，主要原因在于TSCC浸润性转移较快、发现较晚[10]。研究表明，TSCC的5年生存率约为30%，3年生存率为41.12%，而单用TNM分期无法对临床及生物学特点频繁变异的TSCC进行评估。Tatetsu等[11]研究证实，胚胎干细胞(ESC)相关的蛋白在多种恶性肿瘤中高表达，并与肿瘤的侵袭性和不良预后相关；特别在维持ESC多能性和自我更新方面有重要作用的转录因子Oct4和Sox2。Zhang等[12，13]研究表明二者在体内外稳定表达能促进肿瘤细胞的生长，促进肿瘤的复发与转移，增强肿瘤的耐药能力，在肿瘤的发生、发展及预后中发挥重要作用。

Oct4主要作用是维持ESCs的多能性状态，在正常成熟细胞中不表达，近来发现在口腔癌干细胞中表达。本研究中Oct4在舌正常黏膜基底层同样表达。与舌正常黏膜组织相比，Oct4蛋白在TSCC中阳性表达率高；且Oct4蛋白阳性表达与患者年龄、性别、吸烟史、饮酒史、肿瘤临床分期无关，与肿瘤组织学分级相关。Oct4蛋白阳性表达率越高，肿瘤分化程度越低。表示Oct4在TSCC组织中可能促进低分化表型的TSCC细胞丧失分化能力。Oct4蛋白表达与淋巴结转移相关，Oct4蛋白阳性表达率越高，TSCC患者越容易发生淋巴结转移，提示Oct4可能与肿瘤的侵袭和浸润相关，与Lopes等[14]报道一致。

Sox2属于转录因子SOX基因家族，参与性别、神经发育、多种血细胞生存等发育过程的调控。项保利等[15]研究表明，Sox可调控干细胞和诱导多能干细胞。在肿瘤的发展中，Sox调控的CSC自我更新和增殖，形成各种类型癌细胞，被认为与肿瘤复发和转移密切相关。本研究结果示，Sox2蛋白在TSCC中阳性表达率高，且与患者年龄、性别、吸烟史、饮酒史、肿瘤临床分期无关，与肿瘤组织学分级相关。即Sox2蛋白阳性表达率越高，肿瘤分化程度越低。Züllig等[16]研究同样证实，Sox2具有使TSCC细胞保持低分化的能力。本研究显示，Sox2蛋白表达与淋巴结转移相关，Sox2蛋白阳性表达率越高，TSCC患者越容易发生淋巴结转移，提示Sox2可能与肿瘤的侵袭和浸润相关，这与Qiao等[17]研究结果一致。

本研究结果提示，与Oct4、Sox2蛋白阴性表达患者相比，Oct4、Sox2蛋白阳性表达的患者总生存率明显降低。且多因素分析发现：Sox2、淋巴结转移可作为TSCC患者总生存率的独立预测因素。姜新娣等[18]研究结果也表明，Oct4高表达的患者生存率低。Yoshihama等[19]研究表明，Oct4和Sox2共表达谱为乳腺癌的生物学标志物。Park等[20]研究也证明其与肝癌、口腔癌的预后密切相关。因此Oct4和Sox2共表达谱在维持CSC的生物学行为方面发挥重要作用。本研究结果示：Oct4和Sox2蛋白同时阳性表达的患者总生存率低。提示联合检测Oct4、Sox2蛋白表达比单独检测可更精准地反映TSCC预后。

综上所述，Oct4、Sox2蛋白阳性表达率越高，TSCC组织学分级越低，越容易发生淋巴结转移，且Oct4、Sox2蛋白同时阳性表达者总生存率最低。Sox2及淋巴结转移可作为TSCC患者总生存期的独立预测因素，为临床治疗及检测提供了较为可靠的方案。但是本文缺陷在于样本量较小，下一步仍需扩大样本量进行研究。

参考文献：

[1] Safa AR. Resistance to cell death and its modulation in cancer stem cells[J]. Crit Rev Oncog, 2016,21(3-4):203-219.

[2] Fossum CC, Chintakuntlawar AV, Price L, et al. Characterization of the Oropharynx: Anatomy, Histology, Immunology, squamous cell carcinoma & surgical resection[J]. Histopathology, 2017,70(7):1021-1029.

[3] Villodre ES, Kipper FC, Pereira MB, et al. Roles of OCT4 in tumorigenesis, cancer therapy resistance and prognosis[J]. Cancer Treat Rev, 2016,51(4):12-24.

[4] Yang TL, Wang CP, Ko JY, et al. Association of tumor satellite distance with prognosis and contralateral neck recurrence of tongue squamous cell carcinoma[J]. Head Neck, 2008,30(5):631-638.

[5] Rizzino A, Wuebben EL. Sox2/Oct4: A delicately balanced partnership in pluripotent stem cells and embryogenesis[J]. Biochim Biophys Acta, 2016,1859(6):780-791.

[6] Samantha K, Hermes G, Benjamin B. Yin Yang 1 is associated with cancer stem cell transcription factors (SOX2, OCT4, BMI1) and clinical implication[J]. J Exp Clin Cancer Res, 2016,35(1):1-14.

[7] Kumar SM, Liu S, Lu H, et al. Acquired cancer stem cell phenotypes through Oct4-mediated dedifferentiation[J]. Oncogene, 2012, 31(47):4898-4911.

[8] Almangush A, Heikkinen I, Mäkitie A A, et al. Prognostic biomarkers for oral tongue squamous cell carcinoma: a systematic review and meta-analysis[J]. Br J Cancer, 2017,117(6):856-866.

[9] Weina K, Utikal J. SOX2 and cancer: current research and its implications in the clinic[J]. Clin Transl Med, 2014,3(1):10-19.

[10] Wuebben EL, Rizzino A. The dark side of SOX2: cancer - a comprehensive overview[J]. Oncotarget, 2017,8(27):44917-44943.

[11] Tatetsu H, Kong NR, Gao C, et al. SALL4, the missing link between stem cells, development and cancer[J]. Gene, 2016,584(2):111-119.

[12] Zhang X, Hua R, Wang X, et al. Identification of stem-like cells and clinical significance of candidate stem cell markers in gastric cancer[J]. Oncotarget, 2016,7(9):9815-9831.

[13] Chiou SH, Yu CC, Huang CY, et al. Positive correlations of Oct-4 and Nanog in oral cancer stem-like cells and high-grade oral squamous cell carcinoma[J]. Clin Cancer Res, 2008,14(13):4085-4095.

[14] Lopes SRC, Prass TS. Association of differential β-catenin expression with Oct-4 and Nanog in oral squamous cell carcinoma and their correlation with clinicopathological factors and prognosis[J]. Head Neck, 2015,37(7):982-993.

[15] 项保利,李琳琳,曹亮,等.肺癌患者中转录因子Oct4和Sox2的表达及与肺癌病理分级和临床分期的相关性[J].湖南师范大学学报(医学版),2016,13(1):95-97.

[16] Züllig L, Roessle M, Weber C, et al. High sex determining region Y-box 2 expression is a negative predictor of occult lymph node metastasis in early squamous cell carcinomas of the oral cavity.[J]. Eur J Cancer, 2013,49(8):1915-1922.

[17] Qiao B, He B, Cai J, et al. The expression profile of Oct4 and Sox2 in the carcinogenesis of oral mucosa[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2014,7(1):28-37.

[18] 姜新娣,罗刚,王新红,等.Oct4与Sox2在舌鳞状细胞癌中的表达及临床意义[J].中华口腔医学杂志,2017,52(1):27-33.

[19] Yoshihama R, Yamaguchi K, Imajyo I, et al. Expression levels of SOX2, KLF4 and brachyury transcription factors are associated with metastasis and poor prognosis in oral squamous cell carcinoma[J]. Oncol Lett, 2016,11(2):1435-1446.

[20] Park E, Park SY, Sun P L, et al. Prognostic significance of stem cell-related marker expression and its correlation with histologic subtypes in lung adenocarcinoma[J]. Oncotarget, 2016,7(27):42502-42512.