UHPLC法同时测定肝康灵颗粒中5个苷类成分*

2018-06-22饶颖黄文平徐旭李艳冯育林罗颖颖杨世林

江西中医药大学学报 2018年4期

★ 饶颖黄文平徐旭李艳冯育林罗颖颖,3* 杨世林,,3

(1.甘肃中医药大学兰州 730000；2.江西中医药大学南昌 330004；3.中药固体制剂制造技术国家工程研究中心南昌 330006)

肝康灵颗粒由绵茵陈、赤芍、栀子、虎杖、田基黄等九味中药加工制成[1]，为江西省南昌市第九医院院内制剂，具有清热利湿、凉血活血的功效，临床上用于各种病毒引起的急性黄疸性肝炎，慢性迁延性肝炎，慢性活动性肝炎[2]。方中赤芍可清热凉血，散瘀止痛，其主要有效成分为白芍总苷，具有保肝、抗炎作用[3]，其中白芍苷和芍药苷为代表成分，对心血管、神经系统都具有一定的免疫作用[4-5]；栀子具有泻火除烦，清热利湿，凉血解毒的功效，其主要有效成分栀子苷具有抗炎、镇痛、利胆等药理作用[6-9]；虎杖具有利湿退黄，清热解毒功效，其主要有效成分虎杖苷具有保肝、利胆等作用[10-11]；田基黄具有清热解毒，利湿退黄功效，其中异槲皮苷具有较好的抗氧化、抗抑郁、降压降脂等多种药理作用[12]。在该品种试行标准中，只有赤芍的薄层鉴别及微生物限度[13]，专属性不强，效果不佳。法律法规的不断健全及国家对药品生产监管力度不断加大，医院制剂的质量要求面临严峻的考验。为了控制该制剂的质量，本实验建立超高效液相色谱(UHPLC)法，同时快速测定颗粒中上述5种成分的含量，该方法操作简单，专属性强，分析时间短，可为肝康灵颗粒的质量评价提供参考依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器岛津LC-30AD型超高效液相色谱仪；AUW220D型电子天平(十万分之一，日本岛津公司)；BS224S型电子天平(万分之一，Sartorius)；KQ250DB型数控超声波清洗器(巩义市予华仪器有限责任公司)；KQ5200型水浴锅(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试药肝康灵颗粒(批号:151201、151202、151203)均购于南昌市第九医院；芍药苷对照品(批号:110736-201640)，虎杖苷对照品(批号: 111575-200502)，栀子苷对照品(批号: 110749-201316)，异槲皮苷对照品(批号: 111809-201403)均购自中国食品药品检定研究所；白芍苷对照品(上海中药标准化研究中心，批号12-1002)，供含量测定使用。乙腈为色谱纯；水为超纯水；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件色谱柱:Shim-pack XR-ODSII C18(2.0 mm×75 mm，1.7 μm)；流动相:乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，梯度洗脱(0～4min，2%～7%A；4～11 min，7%～20%A；11～20 min，20 %～40%A)；检测波长:230 nm；流速:0.3 mL/min，柱温25℃，进样量1.0μL。在该条件下，白芍苷、芍药苷、栀子苷、栀子苷、异槲皮苷色谱峰与相邻峰均有较好的分离效果，阴性样品无干扰。色谱图见图1。

2.2 混合对照品溶液制备精密称取白芍苷、芍药苷、栀子苷、栀子苷、异槲皮苷对照品适量，加甲醇制成每1mL含栀子苷0.07 mg、白芍苷0.05 mg、芍药苷0.7 mg、虎杖苷0.55 mg、异槲皮苷0.03 mg的混合溶液。

1.栀子苷 2.白芍苷 3.芍药苷 4.虎杖苷 5.异槲皮苷

2.3 供试品溶液制备精密称取本品颗粒粉末1.0g，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇25mL，称定重量，超声30min，放冷，再称定重量，稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.4 阴性对照溶液制备分别按处方比例及制剂工艺制备不含赤芍、虎杖、栀子、田基黄的阴性样品，再按“2.3”项下方法制备阴性对照溶液。

2.5 线性关系考察精密吸取“2.2”项下混合对照品储备液，甲醇分别稀释2、5、10、20、50、100倍，混匀，得到系列浓度的混合对照品溶液。在“2.1”项色谱条件下进样测定。以对照品进样量浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标绘制标准曲线，得到栀子苷、白芍苷、芍药苷、虎杖苷、异槲皮苷的回归方程及相关系数。结果见表1。

表1 5个成分的线性回归方程和相关系数

2.6 精密度试验精密吸取混合对照品溶液1 μL，在“2.1”项色谱条件下重复进样6次，记录峰面积。结果，栀子苷、白芍苷、芍药苷、虎杖苷、异槲皮苷峰面积的RSD分别为0.31 %、0.43 %、0.34 %、0.25 %、0.37 %，表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验精密吸取同一供试品溶液(批号: 151202)，在“2. 1”项色谱条件下，于0、2、4、8、12、24 h分别进样，记录色谱峰面积。结果，栀子苷、白芍苷、芍药苷、虎杖苷、异槲皮苷峰面积的RSD分别为1.52 %、1.11 %、0.74 %、1.33 %、1.23 %，表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

2.8 重复性试验精密称取同一批样品(批号:151202)，共6份，按“2. 3”项下方法制备供试品溶液，进样1 μL，记录峰面积。结果，栀子苷、白芍苷、芍药苷、虎杖苷、异槲皮苷平均含有量分别为0.38、0.25、3.53、1.52、0.22 mg /g，RSD分别为1.34 %、1.38 %、1.01 %、1.65 %、2.23 %，表明该方法重复性良好。

2.9 平均加样回收率试验精密称取含有量已知的肝康灵颗粒(批号:151202)样品粉末1.0 g，共6份。精密加入已配制的栀子苷、白芍苷、芍药苷、虎杖苷、异槲皮苷浓度分别为0.015mg/mL、0.01mg/mL、0.14mg/mL、0.06mg/mL、0.009mg/mL的混合溶液25mL，按“2. 3”项下方法制备供试品溶液，在“2. 1”项色谱条件下进样测定，记录峰面积，计算回收率，结果见表2。

表2 加样回收率试验结果

2.10 样品的含量测定取肝康灵颗粒3批(批号:151201、151202、151203，规格7mg/袋)，按“2.3” 项下方法制备供试品溶液，每批3份，记录峰面积，计算其中栀子苷、白芍苷、芍药苷、虎杖苷、异槲皮苷的含有量。结果见表3。

3 讨论

根据选取的指标化学成分，本实验考察不同溶剂的提取(甲醇、50 %甲醇、70 %甲醇、乙醇、水、稀乙醇)以及不同的提取方法(超声、回流)，结果发现，稀乙醇为最佳提取溶剂，提取方式选择超声。在流动相的选择上，比较了乙腈-水，乙腈-冰醋酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液，发现乙腈-磷酸水溶液对色谱峰的分离效果好，拖尾现象不明显。