TapMan荧光定量RT-PCR快速检测乙型流感病毒核酸方法的建立及意义

高洁 严敏 付婷 邵中军

流感作为常见病, 有季节性流行的特点, 病原菌种类较多, 不同病毒有不同检测手段［1］。明确何种病毒所致, 对于进一步治疗有很大帮助, 乙型流感病毒作为仅在人之间传播的一种疾病, 与甲型流感病毒患病表现十分相似［2-4］。根据乙型流感病毒的核酸特点, 进行TapMan荧光定量RT-PCR快速检测现采用较多, 为了探究其效果, 选取不同病毒和送检样本进行实验, 现将结果整理如下。

1 材料与方法

1.1 材料 选择2017年1～4月送至本实验室检验的确诊感染乙型流感病毒的咽拭子24例(均经血清学检测, 确诊为乙型流感病毒), 由北京生物制品研究所提供的甲型流感病毒(H1和H3)、呼吸道合胞病毒、禽流感病毒以及乙型流感病毒,以及用于效价滴定的MDCK细胞。

1.2 试剂 由北京奥科生物技术有限责任公司提供, 引物为乙型流感病毒核酸基因NP的一段保守序列, 只含有一级结构, 碱基数量在20个以内, 各引物不互补；探针5’端识别 FAM, 3’端识别 TAMRA［5］。

1.3 方法 ①选择MDCK细胞将乙型流感病毒进行效价滴定, 分别制成不同浓度的制剂(10.00、1.00、0.10、0.01 TCID50/管), 待实验使用。②选择RT-PCR试剂盒(由NEB公司生产), 进行逆转录和扩增, 35次循环后取产物, 观察特异性条带的存在情况。③提取甲型流感病毒(H1和H3)、呼吸道合胞病毒、禽流感病毒以及乙型流感病毒的核酸, 进行TapMan荧光定量RT-PCR检测。④对不同浓度的乙型流感病毒制剂分别进行常规RT-PCR和TapMan荧光定量RTPCR检测。⑤采用常规RT-PCR和TapMan荧光定量RTPCR检测送检的咽拭子样本, 并与血清学检查结果对比。

1.4 观察指标 ①记录TapMan荧光定量PT-PCR对于不同病毒检测的特异性。②记录常规RT-PCR和TapMan荧光定量RT-PCR检测对于不同浓度的乙型流感病毒的敏感性。③记录对比常规RT-PCR和TapMan荧光定量RT-PCR检测咽拭子样本结果的准确性。

1.5 统计学方法 采用SPSS19.0统计学软件进行数据分析。计数资料以率(%)表示, 采用χ2检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 TapMan荧光定量RT-PCR检测特异性 对于检测甲型流感病毒(H1和H3)、呼吸道合胞病毒、禽流感病毒以及乙型流感病毒, TapMan荧光定量RT-PCR仅对乙型流感病毒呈阳性, 且反应与其他病毒无交叉。

2.2 TapMan荧光定量RT-PCR及常规RT-PCR检测敏感度TapMan荧光定量RT-PCR相比于常规RT-PCR检测, 对于不同浓度的乙型流感病毒敏感度更高。见表1。

表1 TapMan荧光定量RT-PCR及常规RT-PCR检测乙型流感病毒敏感度

2.3 TapMan荧光定量RT-PCR及常规RT-PCR检测准确率对24例送检样本, TapMan荧光定量RT-PCR的准确率为83.33%(20/24), 明显高于常规RT-PCR检测的54.17%(13/24),差异具有统计学意义(P＜0.05)。

3 讨论

流感病毒作为流感发生的致病体, 其有多种不同类型。甲型流感病毒是最多见的一类, 乙型流感病毒与其结构相似,临床表现接近, 但乙型流感病毒大爆发少见, 因此易误诊［6］。流感病毒的检测有多种方法, 血清学检测需要等到体内病毒水平蓄积到一定程度才可发现。常规RT-PCR检测是根据一段乙型流感病毒的一段, 进行逆转录和扩增, 从而获取特异性片段, 以此来判断是否感染此种病毒［7］。这种方法一经发现, 并得到广泛应用, 因为其相对传统方法, 其特异性、敏感度以及耗时均有明显提高。但广泛使用中发现常规RTPCR检测发生假阳性的问题较常出现, 这主要与扩增过程中其他病毒的污染有关［8］。由于甲型流感病毒与乙型流感病毒的结构相似, 也容易导致在检测中出现假阳性。而病毒包括包膜、基质蛋白和核心, 不同类型的病毒的主要区别在于核心的差异。病毒的遗传物质与核蛋白共同构成核糖核蛋白体,而TapMan荧光定量RT-PCR就是根据乙型流感病毒核酸的特异序列作为引物, 并以5’端识别FAM, 3’端识别TAMRA作为探针, 从而避免了出现其他病毒如甲型流感病毒(H1和H3)、呼吸道合胞病毒、禽流感病毒检测阳性, 即交叉反应的出现。同时TapMan荧光定量RT-PCR检测, 均在完全密闭的试管内进行, 因此其发生扩增中受污染的可能性大大降低, 从而降低发生假阳性的可能［9,10］。以上这些原因, 使得TapMan荧光定量RT-PCR相比于以前的常规RT-PCR有更好的特异性、敏感性以及准确率。同时这种方法进一步缩短了检测乙型流感病毒的用时, 并且整个检测过程也更加环保,不会产生对环境有害的物质。

此次研究中, 荧光定量RT-PCR对乙型流感病毒核酸有较强的特异性, 反应与其他病毒之间［甲型流感病毒(H1和H3)、呼吸道合胞病毒、禽流感病毒］不存在交叉, 同时在乙型流感病毒浓度为0.01 TCID50/管的病毒效价仍有较高的敏感性。这体现出其检测特异性和敏感度的优势。对送检样本,TapMan荧光定量RT-PCR相比于常规RT-PCR检测的准确率更高 (P＜0.05)。

综上所述, TapMan荧光定量RT-PCR是快速检测乙型流感病毒核酸的方法, 其特异性、敏感度高, 不受其他病毒的干扰, 在咽拭子送检样本检测的准确率上, 相比其他方法也有优势, 建议临床进行使用。

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［7］ 刘建荣, 宋淑娥, 何莹, 等.实时荧光定量PCR在流感病毒核酸检测中的应用// 公共卫生北京论坛——甲型H1N1流感防控高层研讨会, 2009:1000-1002.

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［9］ 王宇飞.G9型猪轮状病毒TaqMan荧光定量RT--PCR检测方法的建立及初步应用.东北农业大学, 2016.

［10］ 卢亦愚, 严菊英, 冯燕, 等.荧光定量RT-PCR快速检测乙型流感病毒核酸.浙江预防医学, 2005, 17(3):1-3.