利拉鲁肽对脑缺血再灌注损伤大鼠脑自由基代谢及血管内皮生长因子表达的影响

李 强，方 涛，刘 勇，董银华，崔晓旭，田凤石

胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是一种主要由分布于结肠和直肠L细胞分泌的含30个氨基酸的多肽类物质[1]，它通过与胰高血糖素样-1受体(GLP-1R)结合而发挥作用，利拉鲁肽是其类似物，目前国内外学者对利拉鲁肽在阿尔茨海默病、帕金森病、脑卒中等疾病方面做过研究，多项研究表明利拉鲁肽不仅具有降糖作用，还可通过血脑屏障[2，3]，可能通过抑制炎症反应、氧化应激和细胞凋亡[4]等机制发挥神经保护作用。本实验建立脑缺血再灌注模型，观察利拉鲁肽对脑缺血再灌注损伤后大鼠脑组织脑自由基代谢及VEGF的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠60只，雌雄不分，体质量200～250 g，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供。许可证号 SCXK-(军)；利拉鲁肽(由丹麦诺和诺德公司提供，批号：国药准字J20110026)；随机分为假手术组(A组)、脑缺血再灌注(B组)组和利拉鲁肽小剂量组(C组、80 μg/kg)、利拉鲁肽中剂量组(D组、120 μg/kg)、利拉鲁肽大剂量组(E组、160 μg/kg)，每组12只。

1.2 方法

1.2.1 CIR大鼠模型制作 SD大鼠随机分为假手术组、脑缺血再灌注组、利拉鲁肽干预小、中、大剂量组，每组12只。采用Longa线栓法制作动物模型。术前禁食12 h，釆用 10%的水合氯醛(400 mg/kg)进行腹腔注射达到深度麻醉后，沿颈正中切开皮肤，分离并暴露右侧颈总动脉及颈内、 颈外动脉，分别用尼龙线在右侧颈总动脉近心端，颈外动脉分叉处予以结扎，靠近颈总动脉分叉处绕线暂不结扎死。用眼科剪在结扎线远端剪一小口，将尼龙线插入颈内动脉达大脑中动脉，栓线的血管外部分结扎固定。假手术组结扎动脉但不插入栓线，余操作同脑缺血再灌注组。2 h后回抽线栓恢复灌注。利拉鲁肽组于再灌注前30 min，按体质量给予腹腔注射。假手术组及脑缺血再灌注组予以同等体积的生理盐水腹腔注射。

1.2.2 神经功能障碍测定 参照Longa等[5]评分标准对所有大鼠进行神经功能评分：0分：正常，无神经损伤症状，活动正常；1分：神经功能损害轻度，不能完全伸展前爪；2分：神经功能损害中度，向一侧转圈；3分：神经功能损害重度，行走时向对侧倾倒；4分：大鼠不能自发行走，肢体意识丧失或无自发活动。

1.2.3 脑梗死体积检测 采用TTC 染色进行检测；各组分别于再灌注24 h后，处死大鼠后断头取脑，置-20℃冰箱15 min，沿冠状面将其切成5 mm厚切片，将脑片置2%TTC溶液，置于 37 ℃恒温箱中染色20 min，置4%(质量浓度)多聚甲醛中固定。利用图像分析软件Scion Image检测各脑切片梗死面积，脑梗死体积=脑梗死面积×厚度/2。

1.2.4 MDA、SOD 的测定 各组分别于再灌注24 h后，深度麻醉大鼠，脱臼法处死大鼠后立即断头取脑，分析天平称重，按1∶9 (W/V) 加入生理盐水制成10%脑组织匀浆，玻璃匀浆器匀浆，2000 r/min，离心10 min，取上清液。保存于-20 ℃冰箱中待测，分别采用黄嘌呤氧化法、硫代巴比妥酸显色法测定，均严格按照试剂盒说明要求操作。

1.2.5 Western blot检测VEGF浓度 脑组织组织标本加人蛋白裂解液后，采用BCA法进行蛋白定量，蛋白变性后行SDS-PAGE电泳、 转膜封闭，分别加入兔抗大鼠VEGF (1∶1000) 抗体，4 ℃ 孵育过夜。充分洗涤膜后用辣根过氧化物酶耦联的IgG作为二抗，增强化学发光法显色，结果采用Image软件分析。

1.2.6 实时荧光定量 PCR(Real-time PCR，qPCR)检测VEGF 脑组织RNA提取、反转录、PCR扩增等步骤；VEGF引物序列：上游5’-CAG ATC ATG CGG ATC AAA CC-3’，下游5’-TTT CTG GCT TTG TTC TAT CTT TC-3’；反应条件为94 ℃ 15 s；94 ℃ 20 s、55 ℃ 10 s、72 ℃ 10 s，40次循环；72 ℃ 10 min。采用2-△△CT法进行相对定量分析。

2 结 果

2.1 各组神经功能缺损评分及脑梗死体积比较 假手术组未见脑梗死，神经功能缺损评分 0分；脑缺血再灌注组和干预组再灌注24 h可见脑组织肿胀及梗死灶；与脑缺血再灌注组比较，干预组神经功能缺损评分明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；干预组脑梗死体积较脑缺血再灌注组明显减小，差异有统计学意义(P<0.05)；而利拉鲁肽各剂量组比较差异有统计学意义(P<0.05，见表1)，与剂量呈正相关性。

2.2 各组大鼠脑组织MDA、SOD 表达变化比较 与假手术组比较，脑缺血再灌注组大鼠脑组织中MDA含量显著增高，SOD活性显著降低(P<0.05)；与脑缺血再灌注组比较，干预组脑组织中MDA含量均显著降低(P<0.05)，SOD活性显著增加(P<0.05)，且与剂量呈正相关性(见表2)。

2.3 各组大鼠脑组织VEGF蛋白表达变化 Western blot结果可见，假手术组VEGF蛋白表达较少；与假手术组相比，脑缺血再灌注组大鼠VEGF表达增加(P<0.05)。利拉鲁肽干预组大鼠分别与脑缺血再灌注组比较，VEGF蛋白表达显著增加(P<0.05)，而利拉鲁肽各剂量组比较差异有统计学意义(P<0.05，见表2，图1)。

2.4 实时荧光定量PCR检测VEGF mRNA表达情况 脑缺血再灌注组大鼠VEGF mRNA阳性表达水平明显高于假手术组(P<0.05)。利拉鲁肽干预组大鼠分别与脑缺血再灌注组比较，VEGF mRNA表达水平明显增加(P<0.05)，而利拉鲁肽各剂量组比较差异有统计学意义(P<0.05)(见表2)。

表1 脑梗死体积变化及神经功能评分

表2 各组大鼠SOD、MDA、VEGF蛋白表达、VEGF mRNA表达水平

A：假手术组；B：脑缺血再灌注；C：利拉鲁肽小剂量组；D：利拉鲁肽中剂量组；E：利拉鲁肽大剂量组
图1 各组大鼠脑组织VEGF蛋白表达变化

3 讨 论

脑缺血再灌注损伤是由于治疗或者机体自身的代偿机制实现缺血区域的再灌注，可导致组织器官的进一步损伤，脑缺血再灌注损伤的机制十分复杂，包括能量代谢障碍、氧化应激损伤、炎症反应、兴奋性毒性、细胞调亡等。氧化应激反应[6]是造成全脑缺血再灌注损伤的重要机制之一。生理状态下，机体内氧化和抗氧化功能处于动态平衡。脑缺血再灌注时机体氧化功能和抗氧化功能失衡，导致大量氧自由基释放，引起脑损伤[7]。其中 MDA是脂质过氧化产物以及氧化损伤的标志物，其含量可直接反映机体脂质过氧化反应的强弱并间接反映细胞损伤程度[8]；SOD作为内源性自由基清除剂的重要代表，能清除机体的氧自由基[9]，修复受损细胞，间接反映机体抗氧化能力。而促进损伤区域局部血管再生，建立良好的侧支循环是脑缺血再灌注后重要的代偿机制[10]，VEGF是体内诱导血管新生的重要生长因子，被视为血管再生的标志性指标[11]，是神经系统中内皮细胞有丝分裂原，主要通过选择性作用于内皮细胞膜上的VEGF受体，促使内皮细胞分泌相关的胶原酶和组织因子等[12]，同时改变内皮细胞的相关基因表达，从而改变内皮细胞的细胞外基质，促进神经元、神经胶质细胞生长和存活[13～15]。

利拉鲁肽是脑内具有神经保护作用的一种生长因子，在中枢神经系统，GLP-1受体表达于小脑、下丘脑、海马及神经细胞中，可通过促进神经发生、促进神经元修复和新记忆形成、降低脑内淀粉样蛋白合成以及调节突触可塑性，通过维持脑内 Ca2+稳态、抑制细胞凋亡、减少炎症反应以及保护神经元免受氧化应激损伤等发挥神经保护作用[16]。Sato等[17]研究表明利拉鲁肽可以通过抗氧化应激和上调血管内皮生长因子VEGF对脑卒中发挥神经保护效应。糖尿病和非糖尿病大鼠脑缺血前腹腔注射利拉鲁肽，可使梗死体积显著缩小，并抑制细胞凋亡和氧化应激反应[18]。

实验研究结果显示大鼠脑缺血再灌注，MDA和VEGF含量增加，SOD含量减少，给予利拉鲁肽干预后SOD和VEGF含量增加，提示利拉鲁肽可改善脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能障碍，抑制黄嘌呤氧化酶和次黄嘌呤氧化酶的活性，上调VEGF表达促进血管再生，为进一步研究脑缺血再灌注的脑保护机制，提供了新思路。

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