刺血疗法治疗急性痛风性关节炎的效果及对血清代谢产物的影响

邱芳晖 张洪柱

[摘要] 目的 探讨刺血疗法治疗急性痛风性关节炎患者的效果及其对血清代谢产物的影响。 方法 选取杭州市老年病医院2016年3月～2017年11月门诊及住院急性痛风性关节炎患者40例，采用随机数字表法将其分为刺血组和西药组，各20例。刺血组采用刺血疗法，西药组给予秋水仙碱片口服，分别治疗1周。治疗前后进行关节疼痛评分、关节功能积分、血尿酸、血沉等指标评估。随机取刺血组患者10例，将治疗前血清作为A组，治疗后血清作为B组，在院内征选健康职工作为志愿者，将10名健康人血清作为D组，运用液相色谱-质谱联用仪（LC-MS）检测A、B、D组血清代谢产物，进行差异性研究。 结果 治疗后两组血尿酸、血沉指标、关节疼痛评分及关节功能积分等指标均较治疗前显著降低（P < 0.05），且刺血组治疗后关节疼痛评分、关节功能积分等指标低于西药组（P < 0.05）。通过代谢组学检测，A组血清中差异性代谢物质有D-葡萄糖酸、L-谷氨酸、次黄嘌呤、白三烯B4；B组和A组之间的差异性代谢物质有L-精氨酸、甘油磷脂、类胰岛素生长因子。 结论 刺血疗法在临床综合疗效方面优于口服秋水仙碱片。根据代谢组学检测结果及KEGG数据库搜索结果，急性痛風性关节炎的发生可能是机体葡萄糖代谢、氨基酸代谢、次黄嘌呤代谢紊乱，血尿酸增高发病，而刺血疗法则是通过影响一氧化氮合成、脂类代谢来维持血管的通畅、改善代谢紊乱来起到治疗作用。

[关键词] 刺血疗法；急性痛风性关节炎；液相色谱-质谱联用；代谢组学；代谢产物

[中图分类号] R589.7 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）04（c）-0135-05

Effect of pricking blood therapy on acute gouty arthritis and its effect on serum metabolites

QIU Fanghui1 ZHANG Hongzhu2

1.Traditional Chinese Medicine Rehabilitation Department， Hangzhou Geriatric Hospital， Zhejiang Province， Hangzhou 310022， China； 2.Shiqiao Ward， Hangzhou Geriatric Hospital， Zhejiang Province， Hangzhou 310022， China

[Abstract] Objective To investigate the curative effect of pricking blood therapy in the treatment of patients with acute gouty arthritis and its influence on serum metabolites. Methods Forty patients with acute gouty arthritis in Outpatient and Inpatient Department of Hangzhou Geriatric Hospital from March 2016 to November 2017 were selected. They were divided into pricking blood group and western medicine group by random number table method， with 20 cases in each group. The pricking blood group was treated with pricking blood therapy， and the western medicine group was given Colchicine Tablets orally， for 1 week respectively. The scores of joint pain index， joint functioning score， blood uric acid and erythrocyte sedimentation rate were evaluated before and after treatment. 10 patients were randomly selected from the pricking blood group. The serum before treatment was taken as group A， and the serum after treatment was taken as group B. Besides 10 healthy people's serum was taken as group D， which were from the volunteers that selected from the healthy employee in the hospital. The serum metabolites of group A， B and D were detected by liquid chromatography - mass spectrometry （LC-MS）， and the difference was studied. Results After treatment， serum uric acid， erythrocyte sedimentation rate， joint pain score and joint functioning score of the two groups were significantly lower than those before treatment （P < 0.05）， and the joint pain score and joint function score of the pricking blood group were lower than those of the western medicine group （P < 0.05）. Tested by metabonomics， the differences in serum metabolites with group A were D- gluconic acid， L-glutamic acid， hypoxanthine， leukotriene B4. And the differences in metabolites between group B and group A were L- arginine， glycerin phospholipid， and insulin like growth factor. Conclusion Pricking blood therapy is better than oral Colchicine in comprehensive efficacy. According to the results of metabonomics detection and KEGG database， we hypothesizes that acute gouty arthritis occurs due to the disturbance of glucose metabolism， amino acid metabolism， hypoxanthine metabolism， and increasing of blood uric acid. And the curative effect of pricking blood therapy is to maintain the patency of the blood vessels and improve the metabolic disorder by affecting the synthesis of nitric oxide and the metabolism of lipids.

[Key words] Pricking blood therapy； Acute gouty arthritis； Liquid chromatography - mass spectrometry； Metabonomics； Metabolites

痛风性关节炎是一种反复发作的关节炎症，主要由血尿酸增高、嘌呤代谢异常导致。由于尿酸盐在皮下组织、关节及其周围沉积，导致关节红肿热痛，最后逐步出现骨与关节的强直、畸形、破坏及功能障碍[1]。西医治疗本病多以对症治疗和黄嘌呤氧化酶抑制剂等为主，然而明显的副作用导致诸多患者对其治疗不耐受[2]。祖国医学刺血疗法临床疗效确切，能有效缓解急性痛风性关节炎局部红肿热痛的症状[3]。本研究应用液相色谱-质谱联用技术（LC-MS），通过观察刺血疗法治疗急性痛风性关节炎患者的临床综合效果，并基于代謝组学研究治疗前后患者血清代谢产物的变化，以探讨急性痛风性关节炎发病机制及刺血疗法治疗急性痛风性关节炎的效应机制。具体研究如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料

患者均来源于2016年3月～2017年11月杭州市老年病医院（以下简称“我院”）门诊及住院患者40例，其中男37例，女3例；年龄37～59岁，平均（47.02±9.45）岁。按随机数字表法将40例患者随机分为刺血组和西药组，各20例。刺血组：男18例，女2例；平均年龄（46.70±8.69）岁；平均病程（1.73±0.91）d。西药组：男19例，女1例；平均年龄（47.33±9.46）岁；平均病程（2.30±1.32）d。两组患者性别、年龄、病程比较，差异均无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。

1.2 诊断标准

西医诊断标准参照《急性痛风性关节炎分类标准》[4]关节液中特异性尿酸盐结晶，或用化学方法或偏振光显微镜证实痛风石中含尿酸盐结晶，具备以下12项（临床、实验室、X线表现）中的6项：①急性关节炎发作>1次；②炎性反应在1 d内达高峰；③单关节炎发作；④可见关节发红；⑤第一跖趾关节疼痛或肿胀；⑥单侧第一跖趾关节受累；⑦单侧跗骨关节受累；⑧可疑痛风石；⑨高尿酸血症；⑩不对称关节内肿胀（X线证实）；■无骨侵蚀的骨皮质下囊肿（X线证实）；■关节炎发作时关节液微生物培养阴性。

中医诊断标准参照《中药新药临床研究指导原则》（试行）[5]的中医湿热蕴结型痛风诊断标准：主症为关节红肿疼痛、发热、关节屈伸不利、关节畸形；次症为口渴、汗出、小便黄、大便干。舌质红、苔黄厚或腻，脉滑数或弦数。

1.3 纳入标准

①符合急性痛风性关节炎的西医诊断标准；②符合痛风性关节炎中医湿热蕴结证的诊断标准；③性别不限，年龄18～65岁；④本次发作急性起病，病程在72 h以内；⑤志愿参与受试，并签署知情同意书；⑥急性起病以来未曾做任何治疗。

1.4 排除标准

①继发性痛风；②正在哺乳期或妊娠期的妇女，或是备孕中的妇女；③合并肝、肾、心脑血管及造血系统的疾病，或精神疾病，难以配合的患者；③晚期痛风性关节炎出现有关节严重变形或肾脏结石者；⑤对本研究方案中药物过敏者，或属于刺血疗法操作禁忌及药物禁忌证。

1.5 脱落标准

①符合纳入标准，治疗中更改治疗方案或服药方案或依从性差，影响了有效性及安全性等项目的判定者；②有严重的不良事件或并发症等，须停止试验者；③自行要求退出试验者，或在疗程结束前退出试验者。

1.6 方法

1.6.1 西药组 嘱患者低嘌呤饮食、戒酒，口服非类固醇抗炎药美洛昔康（莫比克）7.5 mg（上海勃林格殷格翰药业公司，生产批号：A24573、A49487、A53973、A58168、A7102、A7425），每日1次，服用7 d。本组再给予秋水仙碱（昆药股份有限公司，生产批号：15KG、16DL、16DK、16IR、16IS、17EM）进行对照治疗。首次服用1.0 mg（2片），之后每隔2 h服0.5 mg（1片），直至关节症状缓解，如果服药后出现腹泻或呕吐等胃肠道不适则立即停止服药，秋水仙碱达到治疗量一般为3～5 mg（6～10片），出于安全考虑24 h内服用最大量不超过6 mg（12片）。待症状缓解后每日剂量改为1.5 mg（3片），并分3次服用，总共疗程时间为7 d。

1.6.2 刺血组 取穴：阿是穴，即局部关节疼痛或肿胀部位的中心。操作：采用复合碘皮肤消毒棉签对痛点常规消毒后，用右手持一次性血糖采血针，左手紧捏住阿是穴的局部，快速点刺阿是穴，放出血液，如果流出的血液较少，可以用拔火罐的方法将血拔出，对所有阿是穴共放出所需的血量为5 mL，第1、3、5、7天行刺血疗法，1次/d。操作过程中需严格执行无菌操作，术前术后进行手消毒，戴无菌手套。

1.7 实验分组

将刺血组中治疗前患者血清分为A组，治疗后患者血清分为B组，另选取我院健康职工作为志愿者，将10名健康志愿者人血清作为D组。

1.8 样本检测和分析

A组与D组在第1天治疗前清晨空腹采血，B组在疗程结束后第1天清晨空腹采血，采血量均为5 mL，缓慢推入非抗凝性的真空管并静置30 min，然后将装有静脉血液的非抗凝管放入低速离心机离心，离心半径11 cm，4000 r/min，离心10 min去除血细胞。用移液枪采集上清液2 mL于EP管内，加盖密封，-80℃保存。临床上因需要多次采集血清样本才能完成，故每次收集好血清样本后需快速冻存。待所有的血清样本采集完成后，委托相关检测机构采用专业的设备运送往武汉华大医学检验所进行样品检测与分析。采用质谱仪Xevo G2-XS TOF（Waters，USA）进行质谱数据采集，使用软件Progenesis QI（version 2.2）（Waters，USA）和代谢组学R软件包metaX（华大基因）对质谱数据进行深度分析，其中代谢物鉴定基于数据库HMDB，代谢通路分析基于数据库KEGG。

1.9 观察指标

1.9.1 关节功能评定 关节功能评价[6]：①0分，活动无受限；②1分，活动中度受限，但仍可从事正常活动；③2分，活动明显受限，不能从事一般活动，但能生活自理：③3分，活动时疼痛难忍，卧床，生活不能自理。

1.9.2 关节疼痛评分 参照《新药（西药）临床研究指导原则》[7]根据受累关节休息痛程度、压痛程度、肿胀程度三项分别记分，最后各项相加所得即为关节肿痛总分数，满分为8分。具体评分：①关节无活动痛，或无休息痛，或无肿胀，记0分；②关节重压轻度痛，或静止状态下轻度痛，或局部软组织肿胀，记1分；③关节重压中度痛、活动轻度受限，或静止状态下明显疼痛，或关节肿胀伴关节积液，记2分：③关节重度痛伴活动受限，或疼痛难忍，记3分。

1.9.3 疗程前后的血沉（ESR）、血尿酸（UA） 血尿酸检测，患者空腹8 h以上，取黄色促凝管静脉采血，采用尿酸酶-过氧化物酶法，全自动生化仪（奥林巴斯AU5800）内加尿酸检测试剂（宁波美康生物科技有限公司，批号：20160804、20160910、20170503、20170711）进行自动分析；血沉检测，取黑色抗凝管（柠檬酸钠1∶4）静脉采血，采血后须立即颠倒混匀，送至实验室用自动血沉分析仪（希森美康）进行自动分析。

1.9.4 疗程前后的临床症状及体征评价效果 参照《中药新药临床研究指导原则》[5]类风湿性关节炎治疗标准进行疗效判定。①显效：主要症状、体征整体改善率≥75%，尿酸、血沉正常或明显改善；②进步：主要症状、体征整体改善率≥50%，尿酸、血沉有改善；③有效：主要症状、体征整体改善率过≥30%，尿酸、血沉有改善或无改善；④无效：主要症状、体征整体改善率<30%。尿酸、血沉无改善。整体改善率是指关节肿痛指数、关节功能等指标的改善百分率[（治疗前值-治疗后值）/治疗前值×100%]，相加后求其平均值。

1.9.5 不良反应 观察两组不良反应发生情况，主要包括胃肠道反应、头晕头痛、皮疹、肝功能异常等。

1.10 统计学方法

通过SPSS 22.0统计分析软件对临床试验的数据进行分析。等级资料采用秩和检验；计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，计数资料用χ2检验进行统计描述分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。代谢组学分析采用了华大代谢组学研究团队自主开发的代谢组学数据分析流程，可进行单变量和多变量分析，从而获得组间差异代谢物；其方法包括参数检验和非参数检验、差异表达倍数分析、主成分分析PCA、偏最小二乘法判别分析PLS-DA等[8]。

2 结果

2.1 治疗结果

2.1.1 关节肿痛指数和功能积分比较 治疗前两组关节肿痛指数和功能积分比较差异无统计学意义（P > 0.05）。治疗后两组关节肿痛指数和关节功能积分均较治疗前显著降低，且刺血组关节肿痛指数和关节功能积分明显低于西药组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表1。

2.1.2 血尿酸、血沉改善比较 治疗前两组血尿酸、血沉水平比较差异无统计学意义（P > 0.05）。治疗后，两组血尿酸、血沉均较治疗前显著下降（P < 0.05），且刺血组血尿酸、血沉下降与西药组相当，兩者比较差异无统计学意义（P > 0.05）。见表2。

2.1.4 不良反应比较 在治疗过程发生的不良反应中，西药组出现4例（20.0%）不同程度的胃肠道反应，刺血组出现1例（5.0%）局部皮肤瘙痒及红肿，考虑治疗后创面处理不当而引发局部感染，两组均无出现头晕头痛、肝功能异常等不良反应。两组不良反应发生率比较差异有统计学意义（P < 0.05）。

2.2 实验结果

经LC-MS分析，本研究中血清样本对分类有重要贡献的差异性代谢物有3种。见表4。

刺血组B组和A组血清中差异性代谢物质有L-精氨酸（L-Arginine）、甘油磷脂（Glycerol phospholipid）、类胰岛素生长因子（IGF-1）3种代谢物质。与A组比较，B组血清中甘油磷脂下调，而L-精氨酸、类胰岛素生长因子（IGF-1）则上调，根据KEGG数据库的搜索情况主要涉及的代谢有一氧化氮合成、脂类代谢等。见图1（封三）。

在A组与D组的血清样本中共有39种差异离子，基于数据库HMDB和数据库KEGG，对其中代谢物鉴定及代谢通路分析后，本研究有4种差异性代谢物对分类有重要贡献。见表5。

A组和D组血清中差异性代谢物质有D-葡萄糖酸（Gluconic acid）、L-谷氨酸（L-glutamic）、次黄嘌呤（Hypoxanthine）、白三烯B4（Leukotriene B4）。与D组相比，A组血清中D-葡萄糖酸、L-谷氨酸、次黄嘌呤、白三烯含量均上升，根据KEGG数据库的搜索情况主要涉及的代谢有葡萄糖代谢、氨基酸代谢，次黄嘌呤代谢等。见图2（封三）。

3 讨论

痛风是由于机体内血尿酸水平升高和/或高血尿酸水平导致尿酸盐沉积在关节或者其他组织，发病率以及致残率都较高[9-12]。中医上将痛风归类于“痹证”“历节风”“白虎风”“痛痹”等范畴，或因先天禀赋不足，脾肾亏虚，复因过食肥甘厚味，湿聚成痰，湿热内生，痰热互结所致，或有外感风寒湿热，乘虚阻滞经络，气血凝滞所致[13-16]。刺血疗法又称刺络法、放血疗法，是中医学中最古老的治疗疾病方法之一，历代医家多用于急证、热证、实证，通过泻热排毒，疏通龙火两路，从而“通而不痛”[17-20]。

本研究通过临床观察发现，两组患者在治疗后血尿酸、血沉、关节疼痛评分、关节功能评分等指标明显较治疗前下降（P < 0.05），且刺血疗法在关节疼痛评分及关节功能积分方面明显优于秋水仙碱口服（P < 0.05）。通过生理药理学分析，秋水仙碱主要通过抑制关节发炎部位的白细胞聚集，减弱白细胞趋化、黏附、吞噬作用，减少乳酸形成，从而减少尿酸结晶的沉积，减轻局部红肿热痛炎性反应，起到止痛作用，达到治疗痛风性关节炎的目的。中医认为急性痛风性关节炎非单纯急症，为陈旧之疾，刺血疗法通过局部点刺出血，清除瘀阻，使脉络疏通，从而达到泻热消肿、祛瘀止痛的作用。即刺血疗法可以使局部血液循环加快，使沉积于关节的尿酸结晶代谢加快，从而改善血沉及血尿酸指标。此外，秋水仙碱口服需经胃肠道吸收到达血液，临床出现胃肠道不良反应情况较多，因此刺血疗法在发生不良反应的概率上明显低于口服秋水仙碱（P < 0.05）。