ANO1在头颈部鳞癌中的表达及与患者预后的相关性

周宏 李文平 裴斐 吴刚

[摘要] 目的 探讨ANO1在头颈部鳞癌中的表达及与患者预后的关系。 方法 运用Oncomine数据库分析ANO1 mRNA在头颈部鳞癌组织与正常黏膜组织表达的差异性及与预后的关系。收集2017年2～10月在复旦大学附属浦东医院接受手术的喉癌患者的标本，采用RT-PCR检测ANO1 mRNA在喉鳞癌组织（26例）与正常黏膜组织（26例）中的表达情况。检索cBioPortal数据库，分析ANO1 mRNA在头颈部鳞癌中的表达与预后的相关性。 结果 在多种头颈部鳞癌组织中ANO1 mRNA表达显著高于正常黏膜组织，差异有统计学意义（P < 0.05）。运用Rickman数据集分析发现ANO1 mRNA高表达与低表达患者的5年总生存率差异无统计学意义（P ﹥ 0.05），而从cBioPortal数据库（TCGA，Provisional）分析发现ANO1 mRNA高表达与低表达的总生存率、无疾病/进展生存率差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 ANO1在头颈部鳞癌组织中的表达高于正常黏膜组织，ANO1高表达的患者，生存期较短，预后较差。

[关键词] ANO1；头颈部鳞状细胞癌；预后；数据库

[中图分类号] R739.91 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）04（c）-0017-04

Expression of ANO1 and its correlation with the prognosis of head and neck squamous cell carcinoma

ZHOU Hong LI Wenping PEI Fei WU Gang

Department of Otorhinolarygology Head and Neck Surgery， Fudan University Pudong Medical Center， Shanghai 201399， China

[Abstract] Objective To investigate the expression of ANO1 in head and neck squamous cell carcinoma （HNSCC） and to determine the prognostic value of ANO1 for HNSCC patients. Methods The differences of ANO1 mRNA expressions in HNSCC and normal mucosa tissues were analyzed based on Oncomine database. The specimens of patients undergoing surgery with laryngeal cancer in Fudan University Pudong Medical Center from February to October 2017 were collected. ANO1 mRNA expressions in laryngeal cancer （26 cases） and normal mucosa tissues （26 cases） were determined using RT-PCR. The relationship between ANO1 mRNA expression and prognosis of HNSCC patients was analyzed using Oncomine and cBioPortal database. Results The mRNA expression of ANO1 was significantly higher in multipe HNSCC tissues than normal mucosa tissues （P < 0.05）. Using Rickman statistics， there was no significant difference in 5-year overall survival （OS） between ANO1 mRNA high expression and low expression patients （P ﹥ 0.05）. However， there were significant differences in OS and disease/progression-free survival （DFS/PFS） between ANO1 mRNA high expression and low expression patients through searching cBioPortal database （TCGA， Provisional） （P < 0.05）. Conclusion The expression of ANO1 is elevated in HNSCC tissues. Patients with high expression of ANO1 had lower survival than those with low expression.

[Key words] ANO1； Head and neck squamous cell carcinoma； Prognosis； Database、

頭颈部鳞状细胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）是世界第6大常见的好发肿瘤[1]，从解剖位置上包括口咽癌、下咽癌、鼻咽癌、口腔癌和喉癌。据统计，2017年在美国有超过60 000的HNSCC新患者被发现，并且大约有13 000患者死于该疾病[2]。研究证实，HNSCC的发生与烟草、酒精及人类乳头状病毒感染密切相关[3]。目前，早期HNSCC的治疗主要以手术和单独放疗或者同步放化疗为主，晚期HNSCC以多学科综合治疗为主。尽管治疗手段的多样性，但患者的生存率还是比较低。越来越多的研究表明，生物分子物的检测可以评估头颈部肿瘤的预后。

ANO1又称为跨膜蛋白16A，是钙离子激活氯离子通道蛋白家族成员之一[4]。ANO1在体内承担多种生理功能：离子转运、调节其他离子通道、平滑肌收缩、神经元兴奋性控制、细胞增殖和信号传导等[5]。同时，ANO1在多种恶性肿瘤中的作用也得到较大的关注。在恶性肿瘤中由于11q13染色体扩增而呈高表达，参与肿瘤的发生发展过程，且与预后相关[6]。因此，本研究进一步探讨ANO1在HNSCC中的表达情况及与患者预后的相关性。

1 资料与方法

1.1 从Oncomine数据库提取数据

Oncomine数据库（www.oncomine.org）是一个癌基因芯片数据库，主要提供肿瘤基因的相关信息。在本研究中设定筛选条件：①Gene：ANO1；②Cancer Type：Head and Neck Cancer；③Data Type：mRNA；④Analysis Type：Cancer vs. Normal Analysia；⑤Clincal Outcome：Survival Status at 5 Years。通过选择ANO1在癌组织与正常黏膜组织之间表达的倍数关系、P值来显示结果，分析在ANO1 mRNA水平上HNSCC与正常黏膜表达的差异性及与预后的关系。

1.2 从cBioPortal 数据库提取数据

cBioPortal数据库（www.cbioportal.org）整合了癌症基因图谱（TCGA）和国际癌症基因组联盟（ICGC）等多个数据库的数据，主要提供癌症基因组数据、综合分析基因组数据和临床资料等。检索cBioPortal数据库，依次勾选Head and Neck；Head and Neck Squamous cell carcinoma（TCGA，Provisional）；mRNA Expression z-Scores（RNA Seq V2 RSEM），输入基因ANO1，获得与ANO1基因相关的数据，分析ANO1 mRNA在HNSCC中的表达与预后的相关性。

1.3 RT-PCR方法检测ANO1 mRNA在喉鳞癌中的表达情况

病例标本来源于2017年2～10月在复旦大学附属浦东医院接受手术的26例喉癌患者，其中男24例，女2例；年龄42～75岁，平均63.5岁；病例分期按国际抗癌联盟（UICC）2002分期标准进行，Ⅱ期17例，Ⅲ期9例。术前未行放化疗，术后组织病理诊断均为喉鳞状细胞癌，为原发肿瘤。术中快速将配对的癌组织和癌旁正常黏膜组织标本装在2 mL冻存管中，标记后快速放进液氮罐，在-80℃冰箱保存备用。

采用Trizol法提取喉癌组织及正常黏膜组织中的总RNA。用Qiagen公司反转录试剂盒将mRNA转录为cDNA，以cDNA为模板，在ABI ViiA7实时定量PCR仪（美国ABI公司）中进行后续定量PCR反应。引物购置生工生物工程（上海）股份有限公司，ANO1基因及内参的引物序列如下：ANO1引物：上游5′-CTCCTGGACGAGGTGTATCG-3′，下游5′-GAACGCCACGTAAAAGACGG-3′。GAPDH引物：上游5′-TG？鄄CCCTCAACGACCACTTT-3′，下游5′-GGTCCAGGGG？鄄TCTTACTCCTT-3′。反应结束后，用溶解曲线分析扩增产物的特异性，以2-△△Ct法分析癌组织中ANO1的表达相对于正常黏膜组织中的变化倍数，以此表示目的基因ANO1的相对表达量。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ANO1在HNSCC中的表达特征

通过检索Oncomine数据库，获得了在HNSCC中ANO1 mRNA表达显著高于正常黏膜组织。在Ye数据集中[7]，ANO1 mRNA表达在舌鳞癌（26例）较正常舌黏膜（12例）升高3.824倍（P=4.49），见图1。在Toruner數据集中[8]，ANO1 mRNA表达在口腔鳞癌（16例）较正常口腔黏膜（4例）升高1.712倍（P=0.027），见图2。通过RT-PCR检测，ANO1 mRNA表达在喉鳞癌（26例）较正常喉黏膜（26例）表达显著上调，倍数变化为2倍，差异有统计学意义（P < 0.001），见图3。

2.2 ANO1表达与HNSCC患者的相关性

通过Oncomine数据库检索及临床标本的实验，证实ANO1 mRNA在不同部位的HNSCC中表达较正常黏膜组织显著增高，同时，在Oncomine数据库Rickman等[9]的研究中，提取ANO1与HNSCC预后相关的数据，得出Kaplan-Meier生存曲线，ANO1 mRNA高表达与低表达患者的5年OS差异无统计学意义（P=0.0699）。见图4。

通过检索cBioPortal数据库（TCGA，Provisional），收集530例样本ANO1基因表达数据，按照表达高低分为高表达组（141例）和低表达组（389例），分析ANO1 mRNA表达与患者预后的相关性，得出Kaplan-Meier生存曲线。结果显示，ANO1 mRNA高表达与低表达患者的OS、DFS/PFS差异有统计学意义（P < 0.05）。见图5、6。

3 讨论

HNSCC具有高发病率和死亡率，严重威胁人类健康。据统计，61%的HNSCC患者会出现复发，高达26%的患者发展为远处转移[10]。尽管有多种治疗方法：手术、放化疗、靶向治疗、免疫治疗等，但HNSCC患者5年OS仍不高，为40%，复发和远处转移成为预后差和致死的主要原因[11]。研究表明，HNSCC的发生发展与许多重要的癌基因发生突变及表达异常密切相关[12]。因此，寻找一种分子标志物对评估HNSCC患者预后有非常重要的作用。

ANO1基因定位于11q13.3，編码含8个跨膜结构域的膜蛋白[13]。ANO1在维持生理功能上起着重要的作用，其阴离子转运功能已在小鼠心肌细胞的实验中证实[14]。同时，ANO1在恶性肿瘤的发生发展中起着一定的作用。ANO1在乳腺癌[15]、食管鳞癌[16]、前列腺癌[17]、肺癌[18]等肿瘤中高表达，且与患者的淋巴转移和不良预后相关。有学者发现[19]，ANO1通过其氯离子通道蛋白的活性发挥促进肿瘤细胞增殖的作用，故被认为是极好的肿瘤分子标志物。

本研究通过挖掘Oncomine数据库及对临床标本的检测分析了ANO1分别在舌鳞癌、口腔癌、喉鳞癌和正常黏膜组织的差异性表达，发现ANO1在HNSCC中的表达水平显著高于正常黏膜组织。同时，通过Oncomine数据库分析了ANO1表达与预后的关系，发现ANO1高低表达与预后无显著相关性，推测研究纳入的研究对象较少，而出现无显著相关性。而通过cBioPortal数据库分析，发现ANO1高低表达与患者预后显著相关，ANO1高表达患者，预后较差。因此在HNSCC中，ANO1通过一定的机制影响肿瘤的发生发展。

综上所述，本研究报道了ANO1在HNSCC中的表达显著高于正常黏膜组织，ANO1高表达的患者生存期较短，预后较差。因此有必要进一步研究其作用于肿瘤的机制，对改善患者预后的研究具有一定的理论指导意义。

[参考文献]

[1] Glorieux M，Dok R，Nuyts S. Novel DNA targeted therapies for head and neck cancers：clinical potential and biomarkers [J]. Oncotarget，2017，8（46）：81662-81678.

[2] Bhatia A，Burtness B. Novel Molecular Targets for Chemoprevention in Malignancies of the Head and Neck [J]. Cancers （Basel），2017，9（9）. doi：10.3390/cancers9090113.

[3] Husain N，Neyaz A. Human papillomavirus associated head and neck squamous cell carcinoma：Controversies and new concepts [J]. J Oral Biol Craniofac Res，2017，7（3）：198-205.

[4] 梅丽丽，史志周.钙离子激活的氯离子通道蛋白ANO1在肿瘤发病机制中的作用[J].中国病理生理杂志，2016， 32（4）：759-761，768.

[5] Picollo A，Malvezzi M，Accardi A. TMEM16 proteins：unknown structure and confusing functions [J]. J Mol Biol，2015，427（1）：94-105.

[6] Britschgi A，Bill A，Brinkhaus H，et al. Calcium-activated chloride channel ANO1 promotes breast cancer progression by activating EGFR and CAMK signaling [J]. Proc Natl Acad Sci U S A，2013，110（11）：E1026-E1034.

[7] Ye H，Yu T，Temam S，et al. Transcriptomic dissection of tongue squamous cell carcinoma [J]. BMC Genomics，2008， 9：69.

[8] Toruner GA，Ulger C，Alkan M，et al. Association between gene expression profile and tumor invasion in oral squamous cell carcinoma [J]. Cancer Genet Cytogenet，2004， 154（1）：27-35.

[9] Rickman DS，Millon R，De Reynies A，et al. Prediction of future metastasis and molecular characterization of head and neck squamous-cell carcinoma based on transcriptome and genome analysis by microarrays [J]. Oncogene，2008，27（51）：6607-6622.

[10] Stucky A，Sedghizadeh PP，Mahabady S，et al. Single-cell genomic analysis of head and neck squamous cell carcinoma [J]. Oncotarget，2017，8（42）：73 208-73 218.

[11] Lampri ES，Chondrogiannis G，Ioachim E，et al. Biomarkers of head and neck cancer，tools or a gordian knot？ [J]. International journal of clinical and experimental med？鄄icine，2015，8（7）：10340.

[12] Van Waes C，Musbahi O. Genomics and advances towards precision medicine for head and neck squamous cell carcinoma [J]. Laryngoscope Investig Otolaryngol，2017，2（5）：310-319.

[13] Oh U，Jung J. Cellular functions of TMEM16/anoctamin [J]. Pflugers Arch，2016，468（3）：443-453.

[14] 侯毅鞠，许会静，张雲乔，等.钙激活氯通道ANO1在小鼠心肌细胞的表达及其功能鉴定[J].中国病理生理杂志，2015（3）：539-542.

[15] Wu H，Guan S，Sun M，et al. Ano1/TMEM16A Overexpression Is Associated with Good Prognosis in PR-Positive or HER2-Negative Breast Cancer Patients following Tamoxifen Treatment [J]. PLoS One，2015，10（5）：e126128.

[16] Shang L，Hao JJ，Zhao XK，et al. ANO1 protein as a potential biomarker for esophageal cancer prognosis and precancerous lesion development prediction [J]. Oncotarget，2016，7（17）：24374-24382.

[17] Liu W，Lu M，Liu B，et al. Inhibition of Ca（2+）-activated Cl（-） channel ANO1/TMEM16A expression suppresses tumor growth and invasiveness in human prostate carcinoma [J]. Cancer Lett，2012，326（1）：41-51.

[18] Jia L，Liu W，Guan L，et al. Inhibition of Calcium-Activated Chloride Channel ANO1/TMEM16A Suppresses Tumor Growth and Invasion in Human Lung Cancer [J]. PLoS One，2015，10（8）：e136584.

[19] Wang H，Zou L，Ma K，et al. Cell-specific mechanisms of TMEM16A Ca（2+）-activated chloride channel in cancer [J]. Mol Cancer，2017，16（1）：152.

（收稿日期：2018-03-10 本文編辑：任 念）