应用荧光免疫层析法检测布鲁氏菌病抗体

周柱辉，陈肇源，陈桂霞，潘 杰，张险朋★

（1．广东省东莞市横沥镇农业技术服务中心，广东 东莞 523460；2．东莞市万江农业技术服务中心，广东 东莞 523050；3．广东省东莞市动物疫病预防控制中心，广东 东莞 523086）

布鲁氏菌病简称布病，是由布鲁氏菌（Brucella）引起的一种人畜共患病，广泛分布于世界各地。根据布鲁氏菌的生物学特性和宿主，可将布鲁氏菌分为6个种19个型，即羊种3个型、牛种8个型、猪种5个型、犬种、绵羊附睾种和沙林鼠种，其中羊种、牛种和猪种对人均具有很强的致病性，尤其以羊种的致病力最强，约80%布鲁氏菌病的感染是由羊种布鲁氏菌引起。布鲁氏菌在家畜和野生动物中主要侵害生殖系统，在母畜中主要引起流产，公畜中主要引起睾丸炎和附睾炎，单侧睾丸肿大，导致不育症。人类主要通过饮用感染布鲁氏菌病奶牛的生奶、油或直接接触感染动物和受污染的动物产品而被感染。人感染布病表现为持续性感染、间歇性流感样症状，称作“波状热”。布鲁氏菌病为世界动物卫生组织（OIE）须通报的动物疫病，我国将其列为二类动物疫病,根据全国法定传染病疫情统计，2017年我国人感染布鲁氏菌病例数为41241例。由于布鲁氏菌是细胞内寄生菌，人感染布病后往往难以治愈，因此给人类健康和畜牧业生产带来严重的危害。近年来，人感染布病数有上升的趋势，因此加强对动物的监测对布病的防控具有很重要的作用。

布病血清学检测的方法主要有凝集试验、补体结合试验、酶联免疫吸附试验、荧光偏振分析技术、胶体金免疫层析技术等，但各种检测方法都存在着不同的缺点。近年来，荧光免疫层析技术在胶体金层析技术的基础上得到了很大的发展，广泛应用于病原检测的初筛和抗体水平的监测。为了验证荧光免疫层析法检测布鲁氏菌病抗体的可行性，对该方法的特异性、敏感性、稳定性进行了验证，并对采集的临床样品进行了检测，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 临床样品

猪血清20份采自屠宰场，牛血清20份采自活牛交易市场，羊血清20份采自养殖场，分离血清，-20℃保存。

1.2 试剂

布鲁氏菌阳性血清购自青岛立见诊断发展中心，批号为：20170503，试管凝集效价为1：800；O型口蹄疫阳性血清、亚洲Ⅰ型口蹄疫阳性血清、猪瘟阳性血清购自中国农业科学院兰州兽医研究所。布鲁氏菌病抗体荧光免疫层析试纸条由成都微瑞生物科技有限公司提供，批号：BRB18011618792。

1.3 仪器

WR-1608荧光检测仪由成都微瑞生物科技有限公司提供。

1.4 方法

1.4.1 特异性试验

分别用样品稀释液1：10稀释布鲁氏菌阳性血清、O型口蹄疫阳性血清、亚洲Ⅰ型口蹄疫阳性血清、猪瘟阳性血清。分别加入稀释的阳性血清80μL到布鲁氏菌病抗体荧光免疫层析试纸条孔中，并用稀释液做空白对照，15min后，用荧光检测仪读取数值，结果判定以T/C值≤0.7判为阳性，＞0.7判为阴性。

1.4.2 敏感性试验

用样品稀释液分别按 1：10、1：20、1：40、1：80、1：160、1：320、1：640稀释布鲁氏菌阳性血清，用移液器吸80μL加入布鲁氏菌病抗体荧光免疫层析试纸条上孔中，15min后，用荧光检测仪读取数值，结果判定以T/C值≤0.7判为阳性，＞0.7判为阴性。

1.4.3 稳定性试验

用样品稀释液1：40稀释布鲁氏菌阳性血清，分别用移液器吸80μL加入布鲁氏菌病抗体荧光免疫层析试纸条上孔中，15min后，用荧光检测仪读取数值。

1.4.4 临床样品检测

用样品稀释液1：10稀释待检血清，用移液器吸80μL稀释的血清加入到布鲁氏菌病抗体荧光免疫层析试纸条上孔中，15min后，用荧光检测仪读取数值，结果判定以T/C值≤0.7判为阳性，＞0.7判为阴性。同时，采用虎红平板凝集试验（RBPT）对该批样品进行检测。

2 结果

2.1 特异性试验结果

采用布鲁氏菌病抗体荧光免疫层析试纸条检测不同阳性血清，只有布鲁氏菌阳性血清为阳性；O型口蹄疫阳性血清、亚洲Ⅰ型口蹄疫阳性血清、猪瘟阳性血清均为阴性，详细结果表1。结果表明，荧光免疫层析法特异性强，对O型口蹄疫阳性血清、亚洲Ⅰ型口蹄疫阳性血清、猪瘟阳性血清无交叉反应。

表1 荧光免疫层析法特异性试验结果

2.2 敏感性试验结果

布鲁氏菌病抗体荧光免疫层析试纸条能检测出到1：320倍稀释的布鲁氏菌病阳性血清为阳性，1：640倍稀释以后的检测结果为阴性，详细结果见表2。结果表明，荧光免疫层析法能够检布鲁氏菌病阳性血清（试管凝集效价1：800）320倍的稀释倍数。

表2 荧光免疫层析法敏感性试验结果

2.3 稳定性试验结果

采用布鲁氏菌病抗体荧光免疫层析试纸条检测10次1：40稀释的布鲁氏菌阳性血清，结果均为阳性，详细结果见表3，变异系数（C.V）值为4.66%，差异不显著。结果表明荧光免疫层析试纸条检测结果稳定。

2.4 临床样品的试验结果

采用布鲁氏菌病抗体荧光免疫层析试纸条检测猪血清20份、牛血清20份、羊血清20份，结果均为阴性，虎红平板凝集试验（RBPT）检测结果均为阴性，详细结果见表4。

3 讨论

表3 荧光免疫层析法稳定性试验结果

表4 部分临床样品布病抗体检测结果

布鲁氏菌病是重要的人畜共患病，属于自然疫源性疾病，可以通过消化道（最为常见）、粘膜、呼吸道、皮肤等多种途径感染。人类主要是通过接触感染的家畜或受其污染的产品，食用消毒不完全的奶制品等途径而感染布鲁氏菌病。对布病的防控，加强动物检疫，开展大规模的布鲁氏菌病监测显得尤为重要。根据试验结果，荧光免疫层析法检测布病抗体，特异性强，可以检出阳性血清（试管凝集效价1：800）320倍的稀释倍数，稳定性好，操作简便，可以在20min内完成检测，适合大规模布鲁氏菌病抗体的监测。

目前，布病抗体血清检测的方法主要有虎红平板凝集试验、试管凝集试验、补体结合试验、酶联免疫吸附试验、荧光偏振分析技术、胶体金免疫层析技术等。虎红平板凝集试验是国标规定的初筛方法，敏感性比较好，操作简便，试验时间短，价格便宜，但是存在假阳性，受人为和环境的影响比较大，并且不能用血浆进行检测，阳性的样品需要进一步确诊。试管凝集试验特异性比较好，是我国的法定检测方法，但是敏感性较差，而且部分感染动物的抗体水平达不到检测出限，容易造成漏检，并且操作复杂，反应时间长，不利于大规模的监测。补体结合试验是公认布鲁氏菌病抗体检测最准确的方法，但是该方法所需要的溶血素的制备困难，试验操作复杂，试验反应时间长，判定有一定的主观性，而且补体结合试验不适于猪布病抗体的检测，我国较少采用该方法。酶联免疫吸附试验操作简便，灵敏度高，特异性较好，可以一次完成大量样品的监测，但目前只有牛的布病抗体ELISA方法是国际贸易中指定的方法，ELISA检测的成本也较高。荧光偏振分析技术是国际贸易中指定的检测方法之一，敏感性和特异性良好，反应时间短，与ELISA方法相比省去了洗板和孵育的时间，是布鲁氏菌病抗体监测的好方法，但需要配置较贵专用仪器，不适合基层推广。胶体金免疫层析技术具有快速检测的特点，不需要配置仪器，但需要通过肉眼判定结果，敏感度不够高，存在假阳性和假阴性。

此次试验的布鲁氏菌病抗体荧光免疫层析法是一种竞争法，采用高敏层析技术快速测定样品中的布鲁氏菌病抗体的含量，充分层析后经荧光仪检测，通过预置的标准曲线自动计算出样品中布鲁氏菌病抗体的含量。该技术比胶体金免疫层析技术的灵敏度要提高100～1000倍，并且采用荧光仪读数，避免了人为因素的干扰，为布病抗体监测提供了一个新技术。此次试验采集临床样品数量和动物种类较少，未能检出布病抗体阳性，这些样品经过虎红平板凝集试验检测结果也为阴性，结果一致，实验室将采集更多的临床样品采用对该方法进行检测，进一步验证该方法的适用性。

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